结直肠腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，WHO(2014)癌症报告显示2012年结直肠肿瘤居全球肿瘤发病率的10%，居男性恶性肿瘤发病率的第3位、女性恶性肿瘤发病率的第2位，位于全球恶性肿瘤病死率的第4位[1]。复发和转移以及对传统治疗的耐受是影响结直肠腺癌预后的主要因素。肿瘤的转移依赖于肿瘤细胞的迁移和侵袭能力：该能力的获得是一个复杂而高度协调的动态过程，涉及细胞与细胞、细胞与细胞外基质黏附作用的改变以及肌动蛋白细胞骨架分子组成及结构的改变等[2]。Fascin-1蛋白作为细胞骨架蛋白家族成员，因其在细胞黏附、迁移及侵袭转移方面的作用[3]，近年成为研究的热点。本文通过RT-PCR、组织芯片及免疫组化EnVision两步法检测Fascin-1蛋白及mRNA在结直肠腺癌组织中的表达，分析其与结直肠腺癌临床病理特征及预后的关系，探讨Fascin-1在结直肠腺癌侵袭转移中的作用及预后价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集甘肃省肿瘤医院2011～2014年原发性结直肠腺癌手术切除标本130例，排除术前接受任何抗肿瘤治疗的患者，每例均取结直肠癌组织及癌旁正常组织(距癌组织约10 cm的正常结直肠组织)作为实验组和对照组，所有组织均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋。其中男性79例，女性51例；年龄37～82岁，中位年龄62岁，右半结肠39例(包括盲肠、升结肠、结肠肝曲、横结肠)，左半结肠91例(包括结肠脾曲、降结肠、乙状结肠和直肠)；高、中分化91例(腺管结构超过95%及50%～95%)，低分化39例(腺管结构0～49%)，黏液腺癌和印戒细胞癌也认定为低分化；浸润深度：T1+T2者31例，T3+T4者99例；淋巴结转移者53例，无淋巴结转移者77例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期者71例，Ⅲ+Ⅳ期者59例。所有病理切片均由两位高年资病理医师根据WHO(2010)消化系统肿瘤分类标准明确诊断及复核；其中40例结直肠腺癌组织及癌旁正常组织从本院组织库获取新鲜标本置于液氮冷冻后，存放于-80 ℃冰箱备用。

1.2 主要试剂 Fascin-1鼠抗人单克隆抗体购自安捷伦公司，免疫组化EnVision两步法试剂盒购自福州迈新公司。引物由金唯智生物科技公司合成，Fascin-1上游引物序列：5′-CAGGGTATGGACCTGTC TG-3′，下游引物序列：5′-GTGTGGGTACGGAAGG CAC-3′；内参GAPDH上游引物序列：5′-CTGGGC TACACTGAGCACC-3′，下游引物序列：5′-AAGTGG TCGTTGAGGGCAATG-3′。RNA提取试剂购自QIAGEN公司，反转录使用美国ABI9700PCR仪，荧光定量PCR仪为安捷伦mx3005p。

1.3 实验方法

增密减氮对不同耐密性春玉米品种产量和光合特性的影响……… 张鹤宇，高聚林，王志刚，于晓芳，孙继颖，胡树平，赵晓宇（26）

1.3.1 RT-PCR检测 (1)RNA提取：依据Qiagen74104试剂盒说明，从液氮罐中取出新鲜冻存的组织，切取约100 mg质量的小块并转入液氮预冷的研钵中，加入2 mL裂解液(Tissuelyser RLT)快速研磨为粉末，然后转入组织匀浆器在冰浴中抽插研磨均一。将裂解液转入离心管中，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，吸取0.7 mL上清液转入预加入0.7 mL 70%乙醇的离心管中，颠倒混匀转入内置RNA吸附柱的离心管中，4 ℃ 10 000 r/min离心5 s，将吸附柱转入新的离心管中，依次用RW1和PRE缓冲液离心清洗。最后将RNA吸附柱置于新离心管中，加入50 μL去离子超纯水，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min洗脱收集RNA。(2)RNA纯度鉴定和定量：取RNA原液1 μL加入49 μL去离子水稀释，用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测核酸吸光度值，经鉴定所有样本RNA的OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间，符合RT-PCR要求。(3)反转录：具体操作步骤按Bio-Rad反转录试剂盒说明书进行，在PCR管中加入4 μL的5×高级反应混合液，1 μL逆转录酶，10 μL去离子水，5 μL RNA液(200 ng/μL)，按46 ℃ 20 min、95 ℃ 1 min、4 ℃ 30 min条件逆转录为cDNA。(4)实时定量PCR：参照QIAGEN208054荧光定量PCR说明书设置反应体系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，10 mmol/L的上、下游引物各0.7 μL，cDNA模板1 μL，超纯水7.6 μL，轻摇混匀上机(安捷伦mx3005p)。反应条件：95 ℃ 2 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s,合计40个循环。

1.3.2 组织芯片制备及免疫组化染色 将获得的供体蜡块行4 μm厚切片，HE染色，显微镜下进行形态学观察，选取富于肿瘤组织且无出血、坏死的典型区域，使用定位器在HE切片和供体蜡块上进行定位。用组织芯片制备仪在供体蜡块中打孔，钻取直径1.5 mm的组织芯，插入空白受体蜡块中，构建成组织阵列块，放入37 ℃温箱中30 min，使组织与受体蜡块紧密结合。将阵列块进行4 μm 厚的常规切片，裱附在经防脱片剂多聚赖氨酸处理过的载玻片上制作成组织芯片，置于60 ℃烤箱中烘烤过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗片。用柠檬酸修复液微波法进行抗原修复，采用免疫组化EnVision两步法染色，实验步骤按试剂盒说明书进行操作。PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照为正常的扁桃体组织，Fascin-1蛋白在扁桃体树突状细胞呈阳性。

[3] Ma Y, Reynolds L E, Li A, et al. Fascin 1 is dispensable for developmental and tumour angiogenesis[J]. Biol Open, 2013,2(11):1187-1191.

1.4.2 Fascin-1蛋白表达的判读 对组织芯片中每个位点进行评分，Fascin-1蛋白在肿瘤的细胞质中着色，呈棕黄色颗粒；参照Hashimoto等[4]的评价标准，Fascin-1蛋白的免疫组化检测判读标准按阳性范围和强度分为4个等级：无着色为0分，<10%的肿瘤细胞胞质中～强着色，或任何比例的肿瘤细胞胞质弱着色为1分；10%～50%的肿瘤细胞胞质中～强着色为2分；>50%的肿瘤细胞胞质中～强着色为3分。其中0分为(-)，1分为(+)，2分为()，3分为()。以“-”和“+”为低表达组，“”和“”为高表达组。

1.4 结果判断

1.4.1 Fascin-1 mRNA相对表达量的判读 以GAPDH为内参，每个样本重复检测2次。先计算每例表达/内参的表达比，然后对T/Nratio采用相对定量法(2△△CT)对结果进行比较分析，计算2个复孔的平均值作为每个样本的实际CT值，同一样本的CT值减去其内参GAPDH的CT值，获得ΔCT值，然后同一组的样本获得1个平均ΔCT值，在所有实验组的ΔCT值中选择1个最大ΔCT(Max)作为衡量的标准，用其他样本组的ΔCT值减去ΔCT(Max)值，最后根据待测基因和内参循环数CT值，按照公式相对值=2△△CT计算待测样本基因相对于内参基因的相对表达量。

1.3.3 随访 从患者手术之日起开始随访，采取门诊复查及电话随访的方式。生存时间从手术之日起，至随访截止时间或患者因肿瘤复发、转移引起死亡的时间。130例结直肠腺癌患者中，27例失访，实际随访103例，随访时间14～65个月，中位随访时间60个月。103例中47例存活，56例死亡，5年生存率为45.6%，其中肝转移致死21例，多器官功能衰竭、恶病质及其他转移致死35例。

此外，本研究尚存在以下不足之处，一是本研究所研究样本数量较小，结果可能产生偏移;二是本研究持续时间较短，无法全面、系统的研究治疗方案对于铅中毒的影响;三是研究尚缺少相应的分子生物学及药理学研究作为理论基础。因此，在本研究基础上进一步大样本量人群研究及开展基础医学研究将为依地酸钙钠及DMSA联合水溶性维生素的治疗慢性铅中毒的研究提供更为完善的理论依据。

2 结果

2.1 Fascin-1 mRNA在结直肠腺癌及癌旁正常组织中的表达 40例腺癌组织中Fascin-1 mRNA的相对表达量(1.309 6±0.947 1)明显高于癌旁正常组织(0.364 1±0.405 3)，两组比较差异有统计学意义(t=5.805，P<0.05，图1、2)。

锅炉输入燃料及其他参数不变，仅改变屏底温度。随着屏底温度提高，火焰中心上移，水冷壁辐射吸热量减少，炉膛上部的过热器吸热量明显增加，水平烟道对流受热面吸热量也相应增加。以A厂四角切圆型锅炉为例，计算屏底温度变化对各级受热面吸热量及各级汽温的影响。

虽然，临泽县近年来加大了农业生产力度，但采取的维护措施存在滞后性。面对农产品的安全问题，政府有关部门要予以高度重视，做好农业绿色化发展引导工作。维护好农业生态环境，对农业的可持续发展起到重要作用。然而，生态环境保护不是一蹴而就的，是需要系统化展开的，唯有长期坚持才能获得良好的效果。面对土壤环境、水环境、空气环境污染日趋严重，要求监督管理部门要加大监督力度，技术部门要采取有效的技术措施予以解决。要定期检测农业生态环境，发现污染及时解决，避免产生二次污染。

  

图1 内参GAPDH在结直肠腺癌及癌旁正常组织中表达的PCR扩增曲线

  

图2 Fascin-1 mRNA在结直肠腺癌及癌旁正常组织中表达的PCR扩增曲线

[4] Hashimoto Y, Skacel M, Lavery I C, et al. Prognostic significance of fascin expression in advanced colorectal cancer: an immunohistochemical study of colorectal adenomas and adenocarcinomas[J]. BMC Cancer, 2006,6:241.

2.3 Fascin-1蛋白在结直肠腺癌及癌旁正常组织中的表达 Fascin-1蛋白阳性定位于细胞质及细胞膜，主要呈棕黄色。癌旁正常组织中，Fascin-1蛋白3例呈()，高表达率为2.3%，其余127例中7例为(+)，120例为(-)；结直肠腺癌组织中，38例呈高表达，其中12例为()(图3)， 26例为()(图4)，高表达率为29.2%，其余92例中31例为(+)(图5)，61例为(-)。结直肠癌组织中Fascin-1蛋白的高表达率显著高于癌旁正常组织，两组间差异具有统计学意义(χ2=35.47，P<0.05)。

 

2.4 Fascin-1蛋白表达与结直肠腺癌临床病理特征的关系 Fascin-1蛋白表达与结直肠腺癌淋巴结转移、TNM分期及肿瘤位置相关；与患者年龄、性别、浸润深度及分化程度无关(表1)。

 

表1 Fascin-1蛋白表达与结直肠腺癌临床病理特征的关系

  

临床病理参数nFascin⁃1蛋白低表达高表达χ2值P值性别 男7959201．4920．222 女513318年龄(岁) ≥626648180．2480．618 <62644420分化程度 高+中分化9166250．4530．501 低分化392613肿瘤位置 右半结肠39201910．2280．001∗ 左半结肠917219浸润深度 T1+T23119121．7680．184 T3+T4997326淋巴结转移 无7761166．5210．011∗ 有533122TNM Ⅰ+Ⅱ7156154．9670．026∗ Ⅲ+Ⅳ593623

*P<0.05

2.5 Fascin-1蛋白表达与结直肠腺癌患者预后的关系 Kaplan-Meier生存曲线显示：103例Ⅰ+Ⅳ期结直肠腺癌患者中，Fascin-1蛋白高表达组患者与Fascin-1蛋白低表达组患者总生存率相比，两者差异无统计学意义(P=0.218，χ2=1.519，图6)。但在44例Ⅲ+Ⅳ期结直肠腺癌患者中，Fascin-1蛋白高表达组患者于Fascin-1蛋白低表达组患者相比，其总生存率低(P=0.046，χ2=3.991，图7)，Fascin-1蛋白高表达组患者平均生存时间为44个月，中位生存时间为51个月；Fascin-1蛋白低表达组患者平均生存时间为52个月，中位生存时间为61个月。Fascin-1蛋白高表达组患者5年总生存率为28.0%；Fascin-1蛋白低表达组患者5年总生存率为39.6%。

  

图6 Fascin-1蛋白高表达组(n=38)与Fascin-1蛋白低表达组(n=92)Ⅰ+Ⅳ期结直肠腺癌患者总生存率的比较

  

图7 Fascin-1蛋白高表达组(n=17)与Fascin-1蛋白低表达组(n=27)Ⅲ+Ⅳ期结直肠腺癌患者总生存率的比较

3 讨论

结直肠腺癌的发病机制涉及一系列癌基因与抑癌基因的突变以及信号转导环节的异常。90%以上的结直肠腺癌与Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活有关，Fascin-1蛋白作为丝状伪足的关键组成部分及细胞骨架蛋白家族成员，是目前唯一定位于丝状伪足全长的肌动蛋白结合蛋白，被认为是Wnt/β-catenin信号通路的新型靶分子。β-catenin信号通路通过调节Fascin-1基因的转录，促进癌细胞的迁移和侵袭[5]。Fascin-1基因定位于染色体7q22，其蛋白质编码产物是相对分子质量为5.5×104的细胞骨架蛋白，通过与F-肌动蛋白结合，形成紧密组装平行排列的肌动蛋白束，使细胞形成丝状伪足、片状伪足、微棘、钉突、树突等细胞突起和细胞质微丝束[6]，进而在细胞的运动迁移及侵袭转移中发挥作用。在正常成人组织中，Fascin-1蛋白在血管内皮、神经元细胞、纤维细胞及成熟树突状细胞中广泛表达[7]。临床应用方面，Fascin-1蛋白是成熟滤泡树突状细胞的可靠标志物，并且在霍奇金淋巴瘤的RS细胞中呈强阳性，可用于与非霍奇金淋巴瘤的鉴别诊断。体外实验中，即时转染Fascin-1 mRNA的HT29人结肠癌细胞株的迁移活性是非转染细胞的6倍，侵袭力是非转染细胞的3倍[8]。Xu等[9]在人胰腺癌细胞株中采用基因转染技术使Fascin-1蛋白表达上调，引起癌细胞株膜突起增多，细胞间连接减少，使细胞的迁移和侵袭能力明显增强；进一步在种植胰腺癌细胞株的裸鼠实验模型中发现，采用基因转染技术提高Fascin-1蛋白的表达，可明显增强肿瘤的运动和侵袭能力。本实验采用RT-PCR进一步从分子水平证实结直肠癌中Fascin-1 mRNA的相对表达量显著高于癌旁正常组织(P<0.01)，且Fascin-1 mRNA的上调表达与淋巴结转移及TNM分期相关(P均<0.05)，提示Fascin-1 mRNA在转录水平即参与结直肠癌的侵袭转移过程。

临床免疫组化研究显示，Fascin-1蛋白在正常上皮中不表达或散在低表达，但在多种上皮来源的恶性肿瘤中显著过表达，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移等预后不良因素相关[10-12]。本组实验采用组织芯片及免疫组化法检测Fascin-1蛋白在结直肠癌中的表达及临床预后意义，结果证实：130例癌旁正常黏膜组织中，仅3例(2.3%)高表达Fascin-1蛋白；结直肠腺癌组织中38例(29.2%)Fascin-1蛋白呈高表达，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。Fascin-1蛋白表达与结直肠癌肿瘤位置、有无淋巴结转移及TNM分期相关；Fascin-1蛋白在淋巴结转移组的结直肠癌患者中的高表达率明显高于无淋巴结转移组，结合Fascin-1蛋白在结直肠癌细胞株中的作用，推测Fascin-1蛋白可能通过改变结直肠癌细胞骨架结构、降低细胞与细胞及细胞与细胞外基质的黏附作用，诱导细胞膜突起形成，增强癌细胞的迁移和侵袭能力，从而诱导癌细胞从原发部位逃逸，最终导致肿瘤的二次复发和转移，提示Fascin-1蛋白可作为结直肠癌侵袭性生物学行为的新型靶标。Fascin-1蛋白在右半结肠癌的高表达率高于左半结直肠癌(P=0.001)，这可能与左半结肠、右半结肠远端的胚胎起源、解剖结构、血液供应及神经支配等存在显著差异有关。大量研究已证实，由于其特有的遗传和分子特征，使右半结肠表现出不同的临床和病理学特征[13]。生存分析显示：Fascin-1蛋白高表达的Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者平均生存时间、中位生存时间均较Fascin-1蛋白低表达的患者短，两者5年总生存率分别为28.0%、39.6%，提示Fascin-1蛋白的表达水平与Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者的不良预后呈正相关，Fascin-1蛋白可作为Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者的生物标志物和潜在的治疗靶点。

利用以上设置的相关参数，得到的内河水域中的流场分布见图2。图2中同时标示漂移物体在不同时刻可能位置的区间范围，当矩形区域与航道边界存在交点时，就存在停止继续漂移的可能性，假设物体的可能位置在相应时刻在矩形区域内为均匀分布，可得到物体最终漂移位置的概率分布情况。

本实验从分子及组织水平证实Fascin-1 mRNA和蛋白在结直肠腺癌中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且与晚期结直肠腺癌患者的不良预后呈正相关，可作为评估Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者预后的有效指标。结合Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌进展中的重要作用，Fascin-1有可能成为结直肠腺癌侵袭转移早期识别的新型靶点，并且为Wnt信号通路的靶向干扰提供新的分子生物学依据。

参考文献：

1.5 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析; 计量资料用描述并采用独立样本t检验；计数资料用例数和高表达率描述并采用χ2检验；绘制Kaplan-Meier生存曲线并进行Log-rank检验。

[1] Stewart B W, Wild C P. World cancer report 2014[M]. Lyon: IARC Press, 2014:392-394.

[2] Kulasingam V, Diamandis E P. Fascin-1 is a novel biomarker of aggressiveness in some carcinomas[J]. BMC Med, 2013,11:53.

最近几年来他们承受着巨大的压力。在经历了数次的前进、后退和重新评估后，去年十月，竞争委员会(Comco)与斯沃琪集团最终达成一项实际上将会影响整个制表业的协议。协议中的具体条款规定，“供应机械机心的义务将持续至2019年12月31日之前。”在2014到2015年，ETA供应了2009-2011年间所销售数量的75%；2016/2017年这一数字降至为65%，而将在未来的2018/2019年则为55%。

2.2 Fascin-1 mRNA的表达与结直肠腺癌临床病理特征的关系 40例新鲜标本中，14例有淋巴结转移组的结直肠腺癌Fascin-1 mRNA的相对表达量(2.111 9±0.922 7)显著高于无淋巴结转移组(0.877 5±0.634 0)，差异有统计学意义(t=4.995，P<0.05)；18例TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的结直肠腺癌Fascin-1 mRNA的相对表达量(2.129 9±0.776 6)显著高于Ⅰ+Ⅱ期结直肠腺癌(0.703 2±0.497 0)，两组间差异具有统计学意义(t=7.080，P<0.05)。

应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

“怎么回事？”鬼子大队长慌忙举起望远镜，从镜头中，他看见高家岭的阵地上，那面被炮火炸烂的青天白日旗高高飘扬着，中国军队的士兵们重新夺回阵地，正在向往下跑的日军猛烈扫射。

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海拉尔盆地某水平井自斜深2 550m进入水平段，水平段全长为500m，全井综合解释411m／24层，含油井段占水平段的82.2%。根据现场地质录井资料，两次提出有可能钻遇非储层或钻出油气层的提示，并建议调整相应的钻井轨迹。

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