目前肺癌居我国恶性肿瘤发病率的首位，近年有增高趋势，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占80%～85%[1]，多数确诊时即为晚期，失去手术机会。临床针对肺癌的分子靶向治疗主要为表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR) 突变型和间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因型，这两种基因变异均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效亦得到明显提高[2]。ALK属于酪氨酸蛋白激酶，肺癌中主要为ALK基因与其他基因发生断裂重排。棘皮动物微管结合样蛋白4(EML4)-ALK融合基因变异是其主要类型，西方NSCLC患者ALK融合基因阳性率为3%～7%，中国NSCLC患者阳性率为3%～11%[3-4]。现阶段针对ALK融合基因常用检测方法有3种：FISH、RT-PCR和免疫组化法[5]。本文采用Ventana抗ALK试剂分析421例晚期NSCLC中ALK的表达，并运用FISH法加以验证，旨在开展易普及的筛查方法，探讨其与NSCLC临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析河北医科大学第四医院2014年4月～2016年5月病理科NSCLC存档标本421例，标本类型包括CT引导经皮肺穿刺标本307例、支气管镜活检标本53例、转移灶穿刺标本51例、胸水沉淀标本10例。男性276例，女性145例；年龄25～85岁，平均59.8岁，中位年龄61岁。所有标本均经免疫组化标记CK5/6、p63、TTF-1、p40等染色证实为鳞癌108例、腺癌266例、其他47例，且均为NSCLC。

1.2 主要试剂及仪器 抗ALK(D5F3)兔单克隆抗体试剂，兔单克隆阴性对照Ig，OptiView DAB免疫组化检测试剂盒均购自美国Roche公司。Vysis ALK FISH检测试剂盒购自Abbott Park公司。

1.3 方法 选取病理科存档蜡块，4 μm厚连续切片，常规HE染色，备切片行免疫组化染色及FISH法检测。采用Ventana全自动免疫组化染色设备和抗ALK兔单克隆抗体检测ALK蛋白的表达，每批检测均设阴阳性对照，光学显微镜下观察结果。免疫组化检测阳性病例，采用FISH法复检，ALK基因的3′和5′分别标记红色和绿色荧光信号，具体操作按ALK检测试剂盒说明书进行，荧光显微镜下观察结果。

1.4 结果判读 (1)组织病理学判断标准：依据WHO(2015)肺癌的分型诊断进行。(2)免疫组化判断标准：参照《Ventana anti-ALK(D5F3)评分解读指南》，采用二分类系统[6]，即阳性和阴性。肿瘤细胞中存在强的颗粒状胞质染色，即为ALK阳性，否则ALK阴性。(3)FISH判断标准：所有肿瘤标本先经HE染色定位癌区，在荧光显微镜下观察100个肿瘤细胞。ALK野生型则呈红、绿色融合(黄色)信号；若>15%肿瘤细胞ALK位点表现以下信号时判读为ALK重排阳性：融合黄色信号+1个红色信号+1个绿色信号，红绿间距超过2倍信号点的宽度；融合黄色信号+1个单独红色信号。

本实验检测421例晚期NSCLC患者活检组织中ALK表达，结果显示ALK阳性率在女性及腺癌中明显升高；与患者年龄、取材部位、吸烟情况无关。通过Ventana全自动免疫组化法检测NSCLC中ALK表达，并经FISH法验证，分析检测结果的吻合率达96.88%。Ventana全自动免疫组化采用二分法，判读标准简单。染色过程中的，时间、温度、试剂添加量均由仪器控制，使检验流程和结果判读得以标准化和简单化，避免传统手工操作的误差，减少主观干扰，与FISH检测具有高度一致性，且检测成本低，易开展，可作为检测晚期NSCLC患者小标本ALK基因状态的筛查手段。

2 结果

2.1 免疫组化检测Ventana ALK表达 421例晚期NSCLC中ALK阳性32例，阳性率为7.6%(32/421)(表1，图1)。

船舶根据船型、大小、和锚链配置情况，走锚程度各不一样，一般船舶干舷高、上层建筑大的船舶受风面积大，容易走锚，空船比受载船舶容易走锚，一般货船比油轮容易走锚（油轮干舷低，上层建筑小），设备老化容易造成船舶走锚、断链等事故。防御台风“山竹”期间，惠州局辖区共接报20宗船舶走锚险情（3宗是船舶锚链断裂），其中7号锚地抛锚的空载散货船“顺昆6”双锚链断裂险情，既有空载干舷高因素，也有锚设备老化因素，较为典型。

 

表1 Ventana ALK在晚期非小细胞肺癌中的表达

  

临床病理参数nALK阳性FISH阳性FISH阴性ALK阴性χ2值P值性别 男27611126413．4050．000 女145200125年龄(岁) ≤612202011992．0160．156 >61201110190组织学类型 腺癌266261239 鳞癌1080010824．3270．000 其他475042取材部位 肺穿刺3072312835．2410．032 支气管镜活检531052 转移灶组织穿刺517044 胸水100010吸烟情况 吸烟2352012141．0260．311 不吸烟186110175

参考文献：

2.3 免疫组化Ventana ALK与FISH检测的一致性分析 经Kappa检验一致性分析，Ventana ALK与FISH检测具有较高的一致性(Kappa=406.798，P=0.000)。结果显示：免疫组化Ventana ALK检测是较为可靠的ALK筛查方法(表2)。

 

表2 Ventana ALK与FISH检测一致性分析

  

FISH检测ALK(D5F3)阳性阴性Kappa值P值阳性310406．7980．000阴性1389

3 讨论

NSCLC在肺癌中占80%～85%，传统的化疗方案对处于进展期的肺癌治疗已处于瓶颈期。EML4-ALK融合基因是NSCLC中继EGFR后，又一个被发现的驱动基因，是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)-克唑替尼(Crizotinib)的作用靶点，既可特异性靶向抑制ALK，也可抑制C-MET和ROS1等信号通路[7]。

 

图1 ALK在晚期非小细胞肺癌中的表达：A.阴性；B.阳性，Ventana法 图2 FISH法检测晚期非小细胞肺癌中ALK表达：A.存在ALK基因融合；B.未发现ALK基因融合

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)被证实在有其独特的临床病理学特征的患者中有效，如亚裔、不吸烟、女性、腺癌。决定EGFR-TKI疗效的关键在于EGFR的 19、21外显子突变。在NSCLC中，如果ALK基因发生断裂、融合，会使该类肺癌患者在克唑替尼治疗中获益，因此准确获得ALK基因状态有助于提高晚期患者个体化治疗，减少盲目治疗[8]。2014年我国一项针对171例晚期NSCLC患者的研究得出ALK阳性率为35.7%(行免疫组化检测)，且在年轻、不吸烟、腺癌尤其是印戒细胞癌和低分化型中其阳性率显著增高[9]。2015年法国多中心研究显示，年轻、女性、不吸烟或轻度吸烟患者的肺腺癌患者ALK阳性率增高(P<0.05)。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验及Fisher 确切概率法，一致性检验采用Kappa检验。P<0.05为差异有统计学意义。

夜幕降临，数千只蚊虫在帐篷外嗡嗡作响，试图闯进，声音如小雨般淅淅沥沥。但我还要吃晚饭，于是，我只好拉上风衣的拉链，迎头冲上去，点上火炉，小步慢跑，直至水沸腾后，再将水倒在脱水食品上，然后回到帐篷。

[6] Zwaenepoel K, Van Dongen A, Lambin S, et al. Detection of ALK expression in non-small-cell lung cancer with ALK gene rearrangements-comparison of multiple immunohistochemical methods[J]. Histopathology, 2014,65(4):539-548.

2.2 FISH检测 为进一步确定Ventana ALK免疫组化染色的准确性，32例阳性的病例均进行FISH检测，经验证后31例为阳性，有分离信号；1例无EML4-ALK基因融合。FISH检测阳性率为7.36%(31/421)。Ventana ALK免疫组化检测与FISH结果的吻合率达96.88%。ALK表达与患者性别及组织学类型相关，女性ALK阳性率(13.79%)明显高于男性(4.15%)；腺癌的ALK阳性率明显高于其他类型(P<0.05)；与患者年龄、取材部位、吸烟情况无关(P>0.05，表1，图2)。

[7] 陈文杰, 李高峰. 非小细胞肺癌的分子靶向治疗研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2017,25(12):1994-1996.

[2] 侯丹阳, 邵 璐, 徐 傲, 等. 免疫组化检测非小细胞肺癌ALK融合基因表达异常[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(5):542-547.

[5] 孙 虎, 张俊萍. 晚期非小细胞肺癌靶向治疗研究进展[J]. 中华临床医师杂志, 2016,10(2):264-269.

[4] 中国医师协会肿瘤医师分会，中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会. 中国表皮生长因子受体基因敏感性突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南(2015版)[J]. 中华肿瘤杂志, 2015,37(10):796-799.

[3] 孙文宇, 闫鹏飞, 原颖丽, 等. ALK基因抑制剂治疗非小细胞肺癌脑转移的研究进展[J]. 国际肿瘤学杂志, 2017,44(6):472-475.

阅读课外名著可以帮助学生健全良好的人格和道德品格。如课外读物《让孩子一生受益的100位名人成长记录》，在学生阅读这本书的时候，一个个名人的故事教会了学生如何坚强的生活，在遇见困难时应该迎难而上，而不是遇难而退；教会他们在今后的人生道路中应该怎样树立正确的价值观、人生观和世界观，提升了他们的道德修养和文学内涵。

[1] 沈 勤, 王 璇, 余 波, 等. 手工免疫组化检测非小细胞肺癌ALK蛋白表达的对比分析[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(3):268-272.

虽然有新面孔上榜，但是以往占据榜单的大户房地产行业依然有百人上榜，占比最高。榜单显示，房地产富豪占据了总富豪榜的1/4，上榜人数达百人，成为产生富豪最多的行业之一。排名前10位中有3位是从事房地产相关行业，分别为去年的首富、排名下降到第三的中国恒大董事局主席许家印，随后是万达集团董事长王健林和排名第六的碧桂园董事局副主席杨惠妍。

[8] 赵 军. 肺癌靶向治疗进展[J]. 临床外科杂志, 2016,24(7):514-517.

孟导突然眼前一惊。这个中年人手里拿着的，正是自己一个月之前被老贾花言巧语糊弄走的钱盒子！孟导不禁脱口而出：“这不是我的钱币盒子吗？”

[9] Zhang N N, Liu Y T, Ma L, et al. The molecular detection and clinical significance of ALK rearrangement in selected advanced non-small cell lung cancer: ALK expression provides insights into ALK targeted therapy[J]. PLoS One, 2014,9(1):e84501.

2.2.3 定期膀胱内化疗指导:膀胱腔内化疗是膀胱肿瘤手术后最常用的治疗。表浅膀胱肿瘤术后复发率高达80%,应用膀胱内化疗大致可能减少一半的复发率。膀胱灌注的治疗可使复发癌细胞的级别和期别降低[3]。膀胱灌注常用的方法:用生理盐水40-50ml加丝裂霉素40mg,经导尿管注入空虚的膀胱,15分钟转动体位使药物接触整个膀胱,原病灶部位可以适当延长,共2小时。初始治疗治疗每周一次,共6-8次,以后每月一次,共1-2年[4]。