骨髓活检结合免疫组化染色对于血液系统疾病诊断、判断临床预后具有重要意义[1]。骨髓组织细胞种类多和组织学形态丰富，部分病例需结合免疫组化染色以明确诊断[2]。骨髓组织质地较硬，需脱钙后才能进行常规制片和免疫组化染色[3]。其中最常用的酸类脱钙液易造成组织细胞表面抗原破坏或丢失，影响免疫组化染色结果[4]。EDTA的脱钙作用优于酸性脱钙液[5]，但脱钙速度慢、脱钙后组织会稍微变硬[6]。本实验通过比较改良EDTA脱钙液脱钙骨髓与混合酸脱钙液脱钙及不脱钙骨髓的HE染色和免疫组化染色效果，探讨改良EDTA脱钙液在骨髓病理诊断中的意义。

1 材料与方法

1.1 脱钙液配制 (1)混合酸脱钙液(pH 3.2)：10%中性福尔马林500 mL+95%乙醇500 mL，加入甲酸200 mL，最后缓慢加入浓盐酸150 mL。(2)改良EDTA脱钙液(pH 7.0)：取乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)250 g，溶于1 350 mL磷酸盐缓冲液中，待溶液彻底溶解后加入40%甲醛150 mL，加入氢氧化钠调溶液pH值为7.0。

三阴性乳腺癌具有特殊的免疫原性，免疫机制可能略有不同，外周血T细胞及其亚群在三阴性乳腺方面未见报道，本研究旨在探讨T细胞及其亚群减少与转移性三阴性乳腺癌预后间的关系，为转移复发性三阴性乳腺癌找到预后预测指标。

1.2 标本制备及分组 选取2016年9月～2017年2月福建医科大学附属第一医院病理科骨髓活检标本61例，其中浆细胞骨髓瘤20例，行CD56、CD38、Kappa和Lambda免疫组化染色；淋巴瘤21例，行CD3、CD20、CD42b、CD68、CD138、CD235a和MPO染色；转移癌20例，行Ki-67染色。每例分为3段，分别放入已做分组标记的包埋盒中：A组经10%中性福尔马林固定后放入混合酸脱钙液，B组直接放入改良EDTA脱钙液，C组经10%中性福尔马林固定后不脱钙直接制片。

1.3 脱钙及脱钙终点的判定 A和B两组在室温下脱钙，A组脱钙时间视骨组织密度而定，一般为3～4 h，B组脱钙时间为20～24 h。以尖镊探测组织已变软或大头针能轻松刺入组织为脱钙完成[7]。

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宋福如：21世纪世界三大科技前沿是信息化、生命科学和新材料，没有新材料就没有工业革命，解决农业难题，也需要用新材料引领一场革命，有机硅材料是高分子化工最有生命力、无毒无害、用途广泛的新材料。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料采用配对χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色 混合酸脱钙液和改良EDTA脱钙液脱钙骨髓组织形态完整，胞核和胞质层次分明，染色均匀，色质鲜艳，对比度好。不脱钙骨髓组织可见钙盐残存，出现“返砂”和“刀痕”现象，组织皱褶，形态和结构破坏严重，核着色深，对比度较差。三组骨髓组织HE切片质量评分详见表1，EDTA脱钙液脱钙骨髓组织制片效果与混合酸脱钙液脱钙骨髓相当(P>0.05)，明显优于不脱钙骨髓(P<0.001，图1)。

所有统计计算均用SASv 9.13统计分析软件进行。定量数据采用t检验、ANOVA或Wilcoxon秩和检验。定性数据用χ2检验、Fisher精确概率、连续校正χ2检验、或Wilcoxon秩和检验，考虑到中心或其他因素的影响采用CMHχ2检验。对于生存数据采用，Log‐rank检验。主要指标的两两比较，采用95%置信区间（95%CI）法，计算双侧95%CI。全部的假设检验均采用双侧检验，取α=0.05。

 

表1 不同脱钙处理组骨髓HE切片质量评分

  

改良EDTA脱钙混合酸脱钙液脱钙(n)效果佳效果不佳P值不脱钙(n)效果佳效果不佳P值效果佳512>0．05251<0．001效果不佳4408

效果佳：≥75分；效果不佳：<75分

2.2 免疫组化染色 CD3、CD20、C38、CD42b、CD56、CD138和CD235a阳性定位于细胞膜，MPO、CD68、Kappa和Lambda阳性定位于细胞质，Ki-67阳性定位于细胞核。三组不同脱钙处理骨髓的12个指标免疫组化染色阳性定位均准确。其中CD56、Kappa、Ki-67、Lambda和MPO经EDTA脱钙液脱钙高表达率与不脱钙组相仿，差异无统计学意义，但明显高于混合酸脱钙液脱钙组，差异具有统计学意义(表2，图2)。其余7个指标经EDTA脱钙液脱钙组高表达率与其余两组差异均无显著性。

3 讨论

 

图1 不同脱钙处理骨髓HE染色：A.混合酸脱钙液脱钙；B.改良EDTA脱钙液脱钙；C.不脱钙 图2 不同脱钙处理骨髓免疫组化染色(Ki-67)：A.混合酸脱钙液脱钙；B.改良EDTA脱钙液脱钙；C.不脱钙，EnVision两步法

 

表2 不同脱钙处理组骨髓免疫组化表达

  

改良EDTA脱钙混合酸脱钙液脱钙高表达低表达P值不脱钙高表达低表达P值CD56(n=20) 高表达1130．002140>0．05 低表达0615Kappa(n=20) 高表达713<0．001200>0．05 低表达0000Ki⁃67(n=20) 高表达020<0．001200>0．05 低表达0000Lambda(n=20) 高表达314<0．001170>0．05 低表达0312MPO(n=21) 高表达813<0．001210>0．05 低表达0000

骨髓组织形态学观察及免疫组化染色前需进行脱钙处理，常规工作中采用的酸脱钙液脱钙程度不易掌握，脱钙时间过长，损害组织抗原导致免疫组化染色阳性率低；脱钙时间过短，脱钙又不彻底，不易制作切片[8]。EDTA是一种优良的钙螯合剂，其脱钙液性质温和，能够有效地保存组织细胞形态结构的完整性(特别是细胞的抗原成分)[9]。有研究比较4%～16%不同浓度EDTA的脱钙效果，结果表明10%和13%的EDTA脱钙效果最佳[5]。因此，本实验选用的是浓度为13%的EDTA。另有研究表明用0.5 mol/L EDTA脱钙液脱钙骨组织DNA提取效率最高[10]，本实验选用的EDTA浓度为0.45 mol/L，能较大程度保存抗原。本实验EDTA脱钙液中加入40%甲醛固定液使固定和脱钙同时进行，可在24 h内使骨髓组织脱钙完全，制片质量良好，抗原保存完整，提高诊断速度和准确度，可以满足临床快速诊断的需要。

综上所述，改良EDTA脱钙液脱钙骨髓HE切片质量佳，免疫组化染色效果好、定位准确，且脱钙时间短，是骨髓活检组织较理想的脱钙液。此外，我们发现CD56、Kappa、Ki-67、Lambda和MPO抗原容易受常规酸性脱钙液影响，而EDTA脱钙液可以弥补该缺陷，提高骨髓疾病诊断的准确性，值得在骨髓活检处理过程中广泛使用。

本实验中EDTA脱钙骨髓组织CD56、Kappa、Ki-67、Lambda和MPO的免疫组化表达强度均好于混合酸脱钙组织；定位于细胞膜(CD56)、细胞质(Kappa、Lambda、MPO)和细胞核(Ki-67)阳性的指标均准确，表达效果较好。有研究显示EDTA能够更完整地保留DNA、RNA和蛋白信号，浆细胞骨髓瘤和多克隆浆细胞浸润经EDTA脱钙者Kappa和Lambda表达完整，均好于酸脱钙组织。另有研究表明EDTA脱钙组织中Ki-67表达优于酸脱钙组织[11]，EDTA作为钙离子和镁离子螯合剂，可释放内皮细胞间接触抑制，促进细胞增殖，表现为Ki-67核表达和有丝分裂象，并呈现为剂量和时间依赖效应[12]，经EDTA处理后更多的人角膜细胞可见核Ki-67表达[13]，与本组中得出的结论一致。MPO是由活化的单核细胞和中性粒细胞脱颗粒释放的血红素蛋白[14]，EDTA通过结合钙离子阻止多形核白细胞脱颗粒抑制MPO从中性粒细胞中释放[15]，因此本组中骨髓组织细胞MPO表达良好，可能与此有关。本组经改良EDTA脱钙液脱钙骨髓除CD56外的白细胞分化抗原表达与混合酸脱钙骨髓无明显差异，其机制有待于大样本进一步分析。

参考文献：

那天，李丽红站在老巴店子门口，喊叫半天，要求老巴送阿里去精神病院。老巴听得心烦意乱。他于是把录音机藏起，跟阿里说，以后不准再放哀乐。阿里没听进他的话，清早起来，仍去放录音，结果百寻不见他的录音机。阿里烦躁起来，翻箱倒柜地找。找不到，便狂怒起来。他把家里几乎所有的东西都掀了。谁的话都不听，谁说什么都不理。老巴想，这样的场面迟早要得经历。如此才能断了他对哀乐的依赖，便由得他去闹。老巴说，得像戒毒一样治一回阿里。街坊们见阿里闹得天翻地覆，恐他伤人，便叫了社区保安过来帮忙制服阿里。

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取两个MAXI计数瓶，分别加入9mL的3-甲氧基丙胺，吸收1.5g～1.6g的CO2后分别加入自配闪烁液，放入液闪谱仪中测量本底。用微型移液器加入0.1mL含14C的正十六烷标准溶液后，再次测量。然后用微型移液器向样品中加入2μL的四氯化碳淬灭剂再测量；重复五次以上，一旦测量结果的SQP（E）值降到550左右就停止。

移动学习中学习评价是在网络课程学习的过程中对学生的学习过程和学习结果进行价值判断的过程[5]。移动学习评价设计的缺失和无效已经成为制约网络课程发挥实际效力的关键因素。54.5%的学生希望针对移动学习进行学习评价。移动学习可以通过在线反馈获取学生的学习评价，Bb平台提供给学生多种学习反馈方式，学生反映不一。58.6%的学生希望可以看到每题得分和总成绩，通过每题的得分状况，对自己掌握的知识进行针对性的学习；33.8%的学生需要教师评语，教师评语可以更加直观、深入的评价学生测试中的问题，便于学生理解与反思。

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1.4 常规HE染色及免疫组化染色 切片行常规HE染色，免疫组化染色采用EnVision两步法。根据染色强度和表达的完整性分级：0为阴性；1+为弱阳性；2+为阳性；3+为强阳性；其中0和1+为低表达，2+和3+为高表达。

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在“白专典型”和“反革命家庭出身”的双重巨大压力之下，邢先生忍辱负重、刻苦做学问，并取得如此突出成绩。邢先生成长的经历告诉我们，好的时代和好家庭出身固然能为人才的成长创造好的环境和条件，有助于人才的进步。但对于一个有理想有抱负有毅力的人来说，即便是在逆境中，他们都能以坚韧顽强的意志，克服重重困难不断成长进步，获得成功。

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