单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）遗传标记因其突变率低、扩增子短等优势而备受法医遗传学界关注，有望在高度降解检材检验、特殊亲权关系鉴定和表型特征推断等方面发挥独特作用[1-11]。常见的SNP分型检验方法有SNaPshot微测序[12]、TaqMan 探针[13]、DNA 芯片[14]、焦磷酸测序[15]、高通量测序[16]和DNA质谱[17-18]等技术，这些方法在各具优势的同时，也存在着检测通量不足、操作步骤繁琐或者实验成本高昂等劣势。但是，DNA质谱技术因操作简便、成本低廉、结果准确等优点，被广泛应用于临床和科研领域的SNP分型检验中，并且美国Agena Bioscience公司还推出了可用于个人身份识别和样本追踪的iPLEX®Sample ID Plus Panel试剂盒。JOHANSEN等[17]的研究显示，该试剂盒具有一定的法医学应用前景。然而，该试剂盒包含的45个常染色体SNP位点尚无法满足我国法医DNA鉴定标准中对系统效能的要求[19]。为此，本研究特针对我国人群，结合实践需求，筛选并建立了基于DNA质谱技术的43重SNP复合检验体系，并对其在华东地区汉族人群中的法医学应用进行评估，旨在与iPLEX®Sample ID Plus Panel试剂盒配合使用，为法医学应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究共收集了123例华东地区汉族健康无关个体的血液样本，其中男性36例，女性87例。所有样本的采集均遵循知情同意原则。

1.2 主要试剂及仪器

QIAamp®DNA Blood Mini试剂盒（德国QIAGEN公司），Complete iPLEX®Pro Genetyping Reagent Set 10×96试剂盒（美国Agena Bioscience公司）。

9700型PCR仪（美国AB公司），MassARRAY®飞行时间质谱仪、MassARRAY®RS1000纳升点样仪（美国Agena Bioscience公司），旋转混匀仪（杭州米欧仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取

按照QIAamp®DNA Blood Mini试剂盒说明书推荐流程提取每名志愿者200μL血液样本中的DNA，并保存于-20℃备用。

1.3.2 位点选择、优化和复合扩增体系设计

根据文献[1，6，7，20-22]报道和本实验室研究积累，选择在中国汉族人群中最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）大于 0.2、符合 Hardy-Weinberg 平衡并且任意两标记间距离大于5 Mb的位点作为候选标记。根据美国Agena Bioscience公司MassARRAY Typer 4.0软件的设计结果，经人工调整，获得43个SNP位点的复合扩增体系（表1）。引物组合比例及反应体系均按照Complete iPLEX®Pro Genetyping Reagent Set 10×96试剂盒推荐比例配制。

表1 复合扩增体系所包含的43个SNP位点及其染色体位置

位点 染色体 染色体位置（GRCh37） 位点 染色体 染色体位置（GRCh37）rs4847034 chr1 105717631 rs2270529 chr9 14747133 rs560681 chr1 160786670 rs7041158 chr9 27985938 rs859400 chr1 175375334 rs1463729 chr9 126881448 rs876724 chr2 114974 rs10776839 chr9 137417308 rs12997453 chr2 182413259 rs964681 chr10 132698419 rs1355366 chr3 190806108 rs901398 chr11 11096221 rs9307465 chr4 119896331 rs4237677 chr11 40192854 rs1396009 chr4 134081686 rs7937238 chr11 77731416 rs6857303 chr4 145035788 rs7104420 chr11 92572940 rs7704770 chr5 159487953 rs590162 chr11 122195989 rs1358856 chr6 123894978 rs2730648 chr12 51537196 rs2272998 chr6 148761456 rs2111980 chr12 106328254 rs214955 chr6 152697706 rs1528460 chr15 55210705 rs727811 chr6 165045334 rs2342747 chr16 5868700 rs1019029 chr7 13894276 rs4796362 chr17 6811529 rs2237427 chr7 42032565 rs1027895 chr17 46510697 rs3802268 chr8 12586261 rs116187 chr17 64497737 rs6474513 chr8 38804226 rs938283 chr17 77468498 rs10098647 chr8 61105199 rs722098 chr21 16685598 rs4288409 chr8 136839229 rs464663 chr21 28023370 rs4606077 chr8 144656754 rs914165 chr21 42415929 rs1001389 chr9 3584543

1.3.3 PCR扩增

扩增体系：10×缓冲液 0.5 μL、25 mmol/L MgCl2 0.4μL、25mmol/L dNTP 0.1μL、扩增引物预混液 0.5μL、5U/μL扩增酶0.1μL和DNA模板10ng，超纯水补充至 5μL。

使用MassARRAY®RS1000纳升点样仪将脱盐后的反应产物上样至Spectro CHIP Array 96点芯片上，通过调节点样针与芯片的时间和点样针的移动速度使上样体积在8～12μL范围内。

扩增条件：95℃预变性 2min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，45个循环；72℃延伸 5min。

（2）分析问题的能力:能够结合其他学科和数据结的基本原理来识别、表达、研究分析非数据处理问题，以获得有效结论。

三联体非父排除率（PEtrio）的计算公式：

反应体系：在扩增产物中加入虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP） 0.3 μL、SAP 缓冲液0.17μL和超纯水1.53μL。

关于实行集体水利工程及其相关水土资源“三位一体”综合改革的思考……………………………………………………… 柳长顺(2.21)

反应条件：37℃孵育40min后，85℃热失活SAP。

1.3.5 单碱基延伸

[24] Indian Navy, Freedom to Use the Sea: India’s Maritime Military Strategy, New Delhi: Integrated Headquarters, Ministry of Defense (Navy), 2007, p. 60.

反应体系：在消化反应产物中加入10×Complete iPLEX®Pro Buffer Plus 0.2μL、Complete iPLEX®Pro Termination Mix 0.2μL、单碱基引物预混液 0.94μL、Complete iPLEX®Pro酶0.04μL和超纯水0.62μL。

反应条件：94℃预变性 30 s；95℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，52℃5s，80℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，40 个循环；72℃延伸3min。

1.3.6 产物脱盐

在单碱基延伸后的反应产物中加入超纯水41μL和预先风干的洁净树脂15 mg，置于旋转混匀仪上孵育并温和混匀15min，然后以4400×g离心5min。

Categorical variables presented as value (%) were analyzed using a χ2 test or Fisher’s exact test with the Yates correction, as needed. P value ＜ 0.05 indicated statistical significance.

老年人日常照料的差序格局反映老年人在需要照料时所能够获得的资源的排序，差序格局以老年人为中心，如图1(老年人日常照顾结构)所示：各个不同角色围绕老年人中心形成一个个圈层，越靠近中心，对老年人的照料支持越大[6]。

1.3.8 飞行时间质谱检验

使用MassARRAY®飞行时间质谱仪对上样后的芯片进行检测，通过MassARRAY Typer 4.0软件查看分型结果。

佛山市禅城区、南海区、顺德区儿童行为问题检出率无差异。考虑与以下因素有关：1）佛山地区位于珠三角经济较发达地区，大部分家庭经济条件较好，对儿童的心理健康教育也比较重视；2）调查中发现，许多中小学校都设有专门的心理咨询室，配备专职心理老师；幼儿园也与医院的儿童心理专家有密切合作，经常邀请心理专家为家长及教师进行有关儿童心理卫生的讲座；3）每年的儿童健康体检，儿童心理行为测试也在该地区的中小学及幼儿园广泛开展，为早期发现心理行为问题及进行早期的干预提供依据。以上的几点也是从小防范心理行为问题值得推荐的较好形式。

1.4 数据分析

式中，Pj为第j个等位基因的Pm值，∏Pj为第k个遗传系统的总Pm值。

式中，Pi为该群体第i个表型的频率。

中学阶段是学生良好阅读习惯形成的重要时期，但从实际情形来看，大多数中学生受到课业负担的压力，同时缺乏对名著阅读的兴趣，课余时间都用来做题或者玩游戏、看电视，很少有学生能静下心来阅读经典名著。此外，许多学生为应付考试，选择阅读老师准备好的压缩名著，以求快速了解名著的主要内容与人物形象，这种阅读缺乏深度，长此以往反而会给学生的阅读能力带来负面作用。

在阴道分娩过程中，高龄产妇最容易发生产程延长或难产。这是因为女人到了中年，其坐骨、耻骨、骼骨和骰骨相互结合部基本已经骨化，孕期韧带松弛度差，使得骨盆变形能力下降。同时临产分娩时，肌肉力量差，易发生宫缩不好，宫颈的扩张力差，也容易发生宫颈水肿、宫口不易开大，即所谓宫颈难产的情况，高龄产妇中剖宫产率显然高于年轻产妇。

多态信息含量（PIC）的计算公式：

式中，n为等位基因数，Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因的频率。

主程序主要实现TMS320F2812芯片各模块功能的初始化和配置，以上设计的各个功能模块均做成了子程序，要想实现整个系统的功能需要在主程序中调用子程序，主程序流程如图8所示。

观察杂合度（Ho）的计算公式：

1.3.7 芯片上样

预期杂合度（He）的计算公式：

式中，n为等位基因数，k为等位基因种类的数目，Pi为第i个等位基因的频率。

1.3.4 dNTP消化

二联体非父排除率（PEduo）的计算公式：

那正是晚饭时间，许灵均的炉子上，煮了一小锅粥。许灵均知道四川逃出来的姑娘可能很久没有粮食下肚了，便决心把那一小锅粥让给女孩吃。秀芝却想，男人劳累了一天，不吃东西怎么行。两个人都坚决不肯吃。最后互相妥协，一人吃一半。可许灵均只有一双筷子一个碗。女孩用筷子和碗。男人撅了两根柴火棍，就在锅里吃。

式中，n为等位基因数，Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因的频率。

累积非父排除率（CPE）的计算公式：

式中，PEk为第k个遗传标记的PE值。

累积个体识别率（CDP）的计算公式：

个体识别率（DP）的计算公式：

2 结 果

2.1 基因分型

本研究构建了包含43个SNP位点的复合检验体系。对123例样本的分型结果显示，除rs10776839位点的分型成功率不足65%以外，其余位点的分型成功率均超过97.56%。

2.2 等位基因频率及其多样性

43个SNP位点的等位基因频率分布见表2。除rs1355366、rs2270529、rs10776839 和 rs938283 外，其余39个位点的MAF值均大于0.25，其中MAF值为0.4～0.5的高多态性位点有24个。此外，rs560681、rs7041158和rs914165 3个位点的MAF值也非常接近0.4。

2.3 法医学评价

经χ2检验，123名华东地区汉族健康无关个体在43个SNP位点上均符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05）。

43个SNP位点的群体遗传学参数见表3。其中DP 为 0.290 1～0.654 4，CDP 为 1-9.8×10-11，PIC 为0.1708～0.5000，Ho 为 0.1557～0.5935，PEtrio为 0.0854～0.2500，PEduo为 0.0146～0.1250。 各 SNP 位点之间相互独立，采用乘积原则计算，CPEtrio为0.999 986，CPEduo为0.9924361。

表2 43个SNP位点的等位基因频率分布 （n=123）

位点 等位基因A T C G A T C G rs4847034 0.4959 0 0 0.5041 rs2270529 0.7705 0 0 0.2295 rs560681 0.6098 0 0 0.3902 rs7041158 0.3943 0 0 0.6057 rs859400 0.4837 0 0 0.5163 rs1463729 0.4628 0 0 0.5372 rs876724 0.4333 0 0 0.5667 rs10776839 0.1835 0 0.8165 0 rs12997453 0.3252 0 0 0.6748 rs964681 0.6545 0 0 0.3455 rs1355366 0.9057 0 0 0.0943 rs901398 0.6626 0 0 0.3374 rs9307465 0.5122 0 0 0.4878 rs4237677 0.5943 0 0.4057 0 rs1396009 0.5285 0 0 0.4715 rs7937238 0.4878 0 0 0.5122 rs6857303 0.4431 0 0 0.5569 rs7104420 0.4756 0 0 0.5244 rs7704770 0.6516 0 0 0.3484 rs590162 0.6382 0 0 0.3618 rs1358856 0.5041 0 0.4959 0 rs2730648 0.5246 0 0 0.4754 rs2272998 0 0 0.4431 0.5569 rs2111980 0.6382 0 0 0.3618 rs214955 0.5854 0 0 0.4150 rs1528460 0.5935 0 0 0.4065 rs727811 0.6829 0 0.3171 0 rs2342747 0.2724 0 0 0.7276 rs1019029 0.4756 0 0 0.5244 rs4796362 0.4309 0 0 0.5691 rs2237427 0.5528 0 0 0.4472 rs1027895 0.6423 0 0 0.3577 rs3802268 0.4593 0 0 0.5407 rs116187 0.4634 0 0 0.5366 rs6474513 0.5041 0 0.4959 0 rs938283 0.8223 0 0 0.1777 rs10098647 0.5041 0 0 0.4959 rs722098 0.4344 0 0 0.5656 rs4288409 0.3577 0 0.6423 0 rs464663 0.3089 0 0 0.6911 rs4606077 0.2520 0 0 0.7480 rs914165 0.3862 0 0 0.6138 rs1001389 0.4106 0 0.5894 0位点 等位基因

表3 43个SNP位点的群体遗传学参数 （n=123）

位点 DP PIC Ho He PEtrio PEduo rs4847034 0.6229 0.5000 0.5041 0.5020 0.2500 0.1250 rs560681 0.6203 0.4759 0.4553 0.4778 0.2380 0.1132 rs859400 0.5769 0.4995 0.5772 0.5015 0.2497 0.1247 rs876724 0.5761 0.4911 0.5667 0.4932 0.2456 0.1206 rs12997453 0.5698 0.4389 0.4878 0.4407 0.2194 0.0963 rs1355366 0.2901 0.1708 0.1557 0.1715 0.0854 0.0146 rs9307465 0.6544 0.4997 0.4228 0.5017 0.2499 0.1249 rs1396009 0.6364 0.4984 0.4715 0.5004 0.2492 0.1242 rs6857303 0.5587 0.4935 0.5935 0.4955 0.2468 0.1218 rs7704770 0.5938 0.4540 0.4672 0.4559 0.2270 0.1031 rs1358856 0.6250 0.5000 0.5000 0.5020 0.2500 0.1250 rs2272998 0.6408 0.3717 0.4472 0.4955 0.2163 0.1218 rs214955 0.6163 0.4854 0.4878 0.4874 0.2427 0.1178 rs727811 0.5973 0.4331 0.3740 0.4348 0.2165 0.0938 rs1019029 0.6334 0.4988 0.4797 0.5008 0.2494 0.1244 rs2237427 0.5888 0.4944 0.5528 0.4964 0.2472 0.1222 rs3802268 0.6063 0.4967 0.5285 0.4987 0.2483 0.1234 rs6474513 0.6142 0.5000 0.5203 0.5020 0.2500 0.1250 rs10098647 0.6443 0.5000 0.4553 0.5020 0.2500 0.1250 rs4288409 0.6094 0.4595 0.4390 0.4614 0.2298 0.1056 rs4606077 0.5357 0.3770 0.4065 0.3786 0.1885 0.0711 rs1001389 0.6027 0.4840 0.5122 0.4860 0.2420 0.1171 rs2270529 0.5202 0.3537 0.3443 0.3551 0.1768 0.0625 rs7041158 0.5872 0.4777 0.5285 0.4796 0.2388 0.1141 rs1463729 0.6158 0.4972 0.5124 0.4993 0.2486 0.1236

表3（续）

位点 DP PIC Ho He PEtrio PEduo rs10776839 0.4647 0.2997 0.3671 0.3016 0.1499 0.0449 rs964681 0.5710 0.4523 0.5122 0.4541 0.2261 0.1023 rs901398 0.5884 0.4471 0.4634 0.4489 0.2236 0.1000 rs4237677 0.6336 0.4822 0.4344 0.4842 0.2411 0.1163 rs7937238 0.6306 0.4997 0.4878 0.5017 0.2499 0.1249 rs7104420 0.6084 0.4988 0.5285 0.5008 0.2494 0.1244 rs590162 0.6031 0.4618 0.4634 0.4637 0.2309 0.1066 rs2730648 0.6352 0.4988 0.4754 0.5008 0.2494 0.1244 rs2111980 0.5714 0.4618 0.5285 0.4637 0.2309 0.1066 rs1528460 0.6324 0.4825 0.4390 0.4845 0.2413 0.1164 rs2342747 0.5567 0.3964 0.3984 0.3980 0.1982 0.0785 rs4796362 0.5951 0.4904 0.5366 0.4925 0.2452 0.1203 rs1027895 0.6094 0.4595 0.4390 0.4614 0.2298 0.1056 rs116187 0.6115 0.4973 0.5203 0.4994 0.2487 0.1237 rs938283 0.4534 0.2922 0.2727 0.2934 0.1461 0.0427 rs722098 0.6451 0.4914 0.4262 0.4934 0.2457 0.1207 rs464663 0.5817 0.4270 0.4228 0.4287 0.2135 0.0912 rs914165 0.6213 0.4741 0.4472 0.4760 0.2370 0.1124

3 讨 论

目前，虽然短串联重复序列（short tandem repeat，STR）遗传标记被广泛应用于国内外法医物证学鉴定[23]中，但是其在实际应用中存在明显的缺陷。首先STR在遗传过程中具有较高的突变率[24-25]，容易导致无法判断亲子关系或错误判断亲子关系的情况。其次，对于高度降解检材，基于毛细管电泳的STR检验可能无法获得全部基因座的完整分型结果，即使配合使用miniSTR试剂盒，也要求检材DNA长度在150 bp以上[26]。因此，针对STR遗传标记的不足，SNP遗传标记因其突变率低和检验所需扩增子短的特点，对于降解检材和亲子关系的检测具有独特的优势，正成为法医遗传学的研究热点。虽然已经有一些针对SNP遗传标记的检验系统被开发出来，但是因检测通量不足、操作步骤繁琐或实验成本高昂等原因，不能满足法医物证学鉴定需要。DNA质谱技术因操作简便、成本低廉、结果准确等优点，而被广泛应用于临床和科研领域的SNP分型检验之中，并且已经有可用于个人身份识别和样本追踪的商品化试剂盒（iPLEX®Sample ID Plus Panel），因此本研究选择了基于DNA质谱技术平台的SNP复合检验系统，筛选并建立了43个SNP遗传标记复合检验体系。复合扩增遗传标记个数是决定检验体系通量、成本和简便程度的直接指标，本研究构建了一个在同一反应池内包含43个SNP位点的复合检验体系。实验结果显示，除rs10776839外，其余位点的分型结果均稳定可靠。与此前文献[27-30]报道的SNP检验系统相比，本系统的检验通量明显提高，虽不及高通量测序[16]，但是已能在相当程度上满足日常检验需要。

本研究结果显示，rs1355366、rs10776839和rs938283的MAF值在本次检验的华东地区汉族人群中均小于0.2，我们将通过对更大人群样本的研究对其进行考察。为了提高本系统在实际检案中的应用能力，我们将对系统进一步优化，并考虑使用其他位点替换分型结果不稳定的rs10776839及MAF值较低的rs1355366和rs938283，并增加性别检验基因座。

43个 SNP位点的 DP在 0.290 1（rs1355366）～0.654 4（rs9307465），其中 40 个位点的 DP 大于 0.5，24个位点的DP大于0.6，43个SNP复合检验体系的CDP为1-9.8×10-11，表明其在华东汉族人群中具有较好的个体识别能力。

国际千人基因组计划（http://www.international genome.org/）的数据显示，iPLEX®Sample ID Plus Panel试剂盒所含45个常染色体SNP位点在我国北京汉族人群中MAF值介于0.4～0.5的高多态性位点仅有18个。本研究筛选并建立的43个SNP位点中MAF值为0.4～0.5的高多态性位点有24个。经计算，iPLEX®Sample ID Plus Panel试剂盒所含45个常染色体SNP位点的CPEtrio和CPEduo分别为0.999 910 6和0.984 529 8。本研究筛选并建立的43个SNP复合检验体系的CPEtrio和CPEduo分别为0.999 986和0.992 436 1，表明其在我国人群中具有良好的法医学应用前景。

我们在系统设计过程中，特别考虑到与iPLEX®Sample ID Plus Panel试剂盒联合使用，因此选择了5个与iPLEX®Sample ID Plus Panel试剂盒重复的位点，分别为 rs876724、rs1463729、rs964681、rs901398和rs914165，作为联合使用时的质量控制位点，并在此基础上选择了38个符合乘积原则的高多态性独立位点。因此，本体系可与iPLEX®Sample ID Plus Panel试剂盒联合使用，其系统效能已经达到或接近于行业标准对个体识别和亲子鉴定的要求[19]。因此，本系统可以用于个体识别或三联体亲子关系鉴定，也可用作对STR标记系统的补充和验证，特别是对于特殊情况下的高度降解检材和出现不符合遗传学规律的亲子鉴定。

在主程序while循环中完成对PWM模块的控制。首先需要判断电机控制方式，如果为手动模式，则根据上位机控制信号中的第二个字节，选择需要使能的组群。然后利用自定义函数PWM_Updata（），根据上位机的电机运转控制信号完成对各电机的转速和转向的控制。如果电机控制方式是自动模式，则直接启动电机自动控制模式，直流电机的运转不再受上位机的电机运转控制信号的控制，而是通过调用自定义函数Auto_Control（）来实现。其流程图如图4所示[15]。

本研究针对我国人群建立了基于DNA质谱技术的43重SNP复合检验体系，并对其在华东地区汉族人群中的法医学应用进行了评估。实验结果显示，该系统具有较高的遗传多态性，既可以作为传统STR遗传标记的有效补充和验证，也可以与其他商品化试剂盒配合使用，以应对高降解检材和出现不符合遗传规律现象亲子鉴定的挑战。本课题组将在今后的工作中继续对位点进行优化并对体系极端适用条件进行测试，以期获得可用于法医物证鉴定实践的SNP检测系统。

总之，基于碳氟键断裂或活化的硼化反应作为新的氟化学和硼化学的交叉研究领域正日益引起人们的关注，新反应、新方法也层出不穷。我们相信将碳氟键的惰性与硼酯基团强大的反应能力相结合，一定会为药物的后阶段修饰策略 (the late-stage drug modification) 提供强有力工具。钯或铁催化的芳基氟的硼化反应[12]发表在Organic Letters, 2018, 20, 5564上，铜催化的偕二氟烯烃的硼化反应[14]发表在Organic Letters, 2017, 19, 3283上。该两项工作得到了国家自然科学基金和中国科学院有机氟化学重点实验室开放课题的支持。

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