雌激素对人体多种生理功能的正常运行至关重 要，既往研究表明，雌激素可促进骨形成，并在促进颌骨细胞增殖分化中发挥重要作用[1，2]。在成纤维细胞因子受体(FGFRs)中，FGFR1主要表达于成骨细胞，具有调节其生长发育的功能。FGFR1作为一种跨膜蛋白，可与其配体结合，将刺激传导入细胞内，通过调控与骨代谢相关的多条信号通路，对各个阶段的成骨细胞进行调控[3，4]。MAPK级联信号通路参与多种细胞反应，是经典的胞内信号转导通路[5，6]。在哺乳动物中发现，细胞外调节蛋白激酶(ERK 1/2)、p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶5(ERK 5)，4种相关的MAPK级联反应。而FGFR1属于酪氨酸激酶受体超家族，能接受胞外信号刺激并与其配体结合，将其传递至胞内，通过多种接头蛋白进而启动MAPK级联信号通路[7]。

本项目组前期通过对MC3T3-E1成骨样细胞施加浓度为10-8moL/l的雌激素刺激后，采用全组基因芯片进行分析，结果显示在雌激素作用下，MC3T3-E1细胞中FGFR1的表达发生明显变化，提示FGFR1参与雌激素对成骨细胞增殖分化等生物学行为的调控，且发挥重要作用[8]。对FGFR1的深入研究发现，FGFR1可作为MAPK信号通路上游因子调控MAPK信号级联反应。因此，深入探讨雌激素作用下，FGFR1对成骨细胞的作用机制，可为骨质疏松的预防和治疗及牙槽骨改建的调控提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 实验材料 MC3T3-E1细胞株(ADCC，美国)，α-MEM培养基(Hyclone)，胎牛血清(四季青)，胰蛋白酶、二甲基亚砜、青霉素链霉素混合液(索莱宝)，FGFR1抑制剂PD166866(sigma，美国)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成)，细胞周期与凋亡检测试剂盒(碧云天)，GAPDH多克隆抗体(康为世纪)，Runx2单克隆抗体、OCN单克隆抗体(CST，美国)，ERK、P-ERK、p38、P-p38、JNK、P-JNK单克隆抗体(CST，美国)等。

1.2 实验方法

（1）在网络爬虫设计中，以建立关键词特征值为基础，针对包装及印刷信息搜索需求制定高效的特征值评分规则，确保了抓取重点，评分机制同时作用于内链接和外链接，确保了抓取范围。

2.4 W estern blot结果(Runx2、OCN) 如图4，图5所示，Western blot结果显示，加入雌激素后MC3T3-E1细胞中Runx2、OCN的蛋白表达水平显著增高(P＜0.05)；而加入FGFR1抑制剂后，各抑制剂组与相同条件下无FGFR1抑制剂组相比，Runx2、OCN蛋白表达水平均显著增高，且不同处理组间细胞的Runx2、OCN蛋白表达水平差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

分组：(1)对照组(DMSO)；(2)抑制剂PD166866(5×10-8moL/l)组；(3)雌激素(10-8moL/l)组；(4)雌激素(10-8moL/l)+抑制剂(5×10-8moL/l)组。

2.3 ALP结果 图3所示，雌激素作用下，成骨细胞的ALP值明显升高(P＜0.05)，且加入FGFR1抑制剂后，各组与相同条件下无FGFR1抑制剂组相比ALP值明显升高，且不同处理组间细胞的ALP值差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

经研究证明，人们在放松时，大脑的学习能力可以增强25%。在钢琴演奏中放松是很重要的，也是最基础的要求，放松在钢琴演奏中的重要性就犹如演奏技巧对于钢琴演奏的重要性一般，身心不放松、缺乏演奏技巧，那么演奏出来的钢琴曲就会变得苍白无力，毫无吸引人的魅力，钢琴演奏的表现力被压缩到了最小化，只有放松才能让钢琴演奏的曲子富有很强的生命力[3]。

1.2.4 ALP活性测定 以7×104/孔的细胞密度接种六孔板，培养48h后，PBS冲洗两遍，每孔加入300μL 1%TritonX-100裂解，提取蛋白后按照BCA试剂盒说明书，配置BCA工作液。采用酶标仪测得各组样品在562nm处的吸光度值，根据标准孔绘制标准曲线，计算蛋白浓度。按说明书在96孔板中加入蛋白及ALP工作液，酶标仪测定520nm下的吸光度值。根据以下公式计算ALP活性：

2.4 Western blot结果(MAPK信号通路关键因子)如图6，图7，图8所示，经雌激素或FGFR1抑制剂处理后，各处理组ERK、JNK、P38三种关键因子总蛋白表达量无明显差异(P>0.05)；但加入雌激素后，ERK、JNK及P38三种关键因子的磷酸化水平显著升高(P<0.05)；而在FGFR1抑制剂作用下，各抑制剂组与与相同条件下无FGFR1抑制剂组相比，三种关键因子中仅ERK的磷酸化水平升高(P<0.05)，JNK、P38的磷酸化水平无明显变化。

 

1.2.6 统计学分析 本文中各组数据以±s)来表示，采用SPSS22.0统计软件(IBM，美国)对各组数据进行分析，并采用q检验对各组数据进行组间两两多重比较，将P<0.05作为有统计学意义的标准。

1.2.5 Western blot细胞以7×104/孔的密度接种六孔板，按以上分组培养48h后，PBS冲洗两遍，根据1m l RIPA加10μL PMSF的比例每孔加入200μL裂解液裂解30m in，超声裂解5sec，BCA试剂盒检测蛋白浓度。根据样品体积加入适量的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸变性。配制SDS-PAGE凝胶后，上样，进行电泳及转膜。然后将PVDF膜浸于5%奶粉封闭液中孵育1h。按GAPDH(1∶5000)，Runx2(1∶1000)，OCN(1∶1000)，Runx2(1∶1000)，ERK(1∶1000)，P-ERK(1∶2000)，p38(1∶1000)，P-p38(1∶2000)，JNK(1∶1000)，P-JNK(1∶2000)的比例用5%脱脂奶粉稀释一抗，加入一抗4℃孵育过夜，TBST清洗后，室温孵育二抗1h，TBST漂洗后，对PVDF膜进行显影。并采用ImageJ图像处理软件测量各条带的面积及灰度值。

为了保证建筑设计质量、降低建筑安全隐患、确保国家及人民的生命财产安全，1997年建设部在上海、武汉、苏州、合肥等城市进行施工图审查试点工作[2]，并于2000年开始实行了施工图审查制度。但传统的审图方式效率低且漏审、错审的概率高。2014年住建部《关于推进建筑业发展和改革的若干意见》建市〔2014〕92 号文件要求：“改进审批方式，推进电子化审查，加大公开公示力度，推进建筑市场监管信息化与诚信体系建设，推进BIM等信息技术在工程设计、施工和运行维护全过程的应用，提高综合效益，探索开展白图替代蓝图、数字化审图等工作” [3]。

2.结果

2.1 MTT结果 如图1所示，雌激素作用下，成骨细胞的MTT值明显高于空白对照组(P＜0.05)，加入FGFR1抑制剂后，与相同条件下无FGFR1抑制剂组相比MTT值明显降低，且不同处理组间细胞的MTT值差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

  

图1 MTT结果直方图

 

“*”、“#”分别代表该组与相同条件下无雌激素组、相同条件下无FGFR1抑制剂组相比P<0.05，具有统计学意义。

2.2 细胞周期实验结果 采用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期情况，结果如图2A、2B所示，雌激素作用下，相比于相同条件下无雌激素组，处于DNA合成期(S期)的细胞比例明显增多，而处于静止期(G1/G0)期的细胞比例下降(P<0.05)，细胞增殖能力提高；而加入FGFR1抑制剂后，各组与相同条件下无FGFR1抑制剂组相比，处于DNA合成期(S期)的细胞比例明显降低，处于静止期(G1/G0)期的细胞比例明显升高，细胞增殖能力下降；且不同处理组间细胞周期比例差异均具有统计学意义(P<0.05)。

1.2.2 MTT测定 细胞按以上分组，以5000个/孔的密度铺于96孔板，每组6个重复孔。培养48h后，PBS缓冲液冲洗两遍，每孔加入200μL完全培养基，20μL MTT溶液。继续培养4h，显微镜下观察细胞结晶后，每孔加入150μL的DMSO溶液，待孔内的结晶完全溶解后，采用酶标仪在490nm条件下，测定各孔的吸光度值并进行计算。

1.2.3 细胞周期测定 细胞以2.5×105个每组接种于大皿，按以上分组培养48h，PBS冲洗后收集细胞，每组收集约5×105个细胞，PBS重悬清洗2次后，加入70%乙醇固定过夜。加入PBS重悬清洗，每组加入500μL配置好的碘化丙啶染色液，37℃孵育30m in后，采用流式细胞仪(BD Accuri C6 Plus)检测细胞周期，Mod fitl T软件处理数据。

  

图2 细胞周期结果(A、B)

  

图3 ALP结果直方图

 

“*”、“#”分别代表该组与相同条件下无雌激素组、相同条件下无FGFR1抑制剂组相比P<0.05，具有统计学意义。

1.2.1 细胞培养 采用含有10%血清，1%100U/m L青霉素、100g/m L链霉素混合液的α-MEM培养基，在37℃、5%CO2，恒温恒湿培养箱中培养MC3T3-E1细胞，待细胞生长至密度为80%-90%时，以7×104/孔的细胞密度接种于六孔板。

  

图4 Runx2蛋白表达结果图

 

“*”、“#”分别代表该组与相同条件下无雌激素组、相同条件下无FGFR1抑制剂组相比P<0.05，具有统计学意义。

  

图5 OCN蛋白表达结果图

 

“*”、“#”分别代表该组与相同条件下无雌激素组、相同条件下无FGFR1抑制剂组相比P<0.05，具有统计学意义。

据了解，康师傅作为大型食品饮料集团，产品使用的原料几乎涵盖了农业产品的各个领域，每年采购农产品数百万吨，使逾4000万农民受益。此外，康师傅对农户和农产品供应商进行全方位扶持，通过创新和科学的力量，帮助农民打造生态农业，从而实现企业发展、供应商盈利、农户增收三方共赢，通过共赢的方式实现食品安全、产业生态与区域经济的可持续发展，从而持久地促进和支持当地的脱贫攻坚。

A组采取耳穴埋豆法治疗，主穴选择盆腔、腹、子宫、皮质子、脾，消毒耳廓，并采用探棒找出穴位的敏感点，采用5 mm×5 mm胶布将行籽贴压于对应的穴位，并采取食指、拇指循耳前后按压，直至局部杆菌胀、麻、酸或是发热感为宜，两只耳朵交替贴穴，每穴按压时间为1 min，1天3次，1个疗程5天，连续治疗3个月。B组采取自拟中药汤剂治疗，主要成分有赤芍、柴胡、大血藤、延胡索、丹参、蒲公英15 g，枳壳、败酱草20 g。将上述方剂煎水200 ml服用，一天1剂。C组采取A+B组的治疗方案。连续治疗3个月，在月经期间暂停用药。

  

图6 p-ERK/ERK蛋白表达结果图

 

“*”、“#”分别代表该组与相同条件下无雌激素组、相同条件下无FGFR1抑制剂组相比P<0.05，具有统计学意义。

  

图7 p-JNK/JNK蛋白表达结果图

 

“*”表示该组与相同条件下无雌激素组相比P<0.05，具有统计学意义。

  

图8 p-P38/P38蛋白表达结果图

 

“*”表示该组与相同条件下无雌激素组相比P<0.05，具有统计学意义。

3.讨论

雌激素能调控成骨细胞的增殖分化，对骨的形成具有重要作用[9，10]；雌激素缺乏易导致绝经后骨质疏松症。此外，雌激素在牙槽骨改建以及促进种植体骨结合中也具有重要作用[11]。本实验所采用的17-β雌二醇是一种效果良好、人工合成的雌激素，多年来广泛应用于临床和实验研究。FGFR1是一种具有调节发育等功能的跨膜蛋白质，与相应配体结合后对不同发育阶段的成骨细胞有不同的生物学效应[4]。本课题组前期实验发现雌激素作用下，MC3T3-E1细胞中FGFR1表达水平发生明显改变，提示FGFR1在雌激素对成骨细胞增殖分化等生物学行为调控的过程中，发挥重要作用[8]。

MTT比色法，是一种常用的检测细胞存活和生长的方法；流式细胞周期实验，能敏感的检测细胞所处的时期，常用于判断细胞的增殖活性；ALP水平常用来判断成骨细胞在骨基质矿化早期的成骨分化活性[12]。本实验采用MTT比色法结合流式细胞周期实验来检测MC3T3-E1细胞的增殖活性；采用ALP比色实验检测MC3T3-E1细胞的分化能力。结果显示：雌激素作用下，其增殖活性和分化能力均显著提高，提示雌激素具有促成骨细胞增殖分化的作用，与前期研究成果相一致[13]。有研究表明，FGF23与K lotho具有促进MC3T3-E1增殖，抑制其分化的作用；但随着FGFR1抑制剂的加入，这种作用可被逆转[3]。本实验中，MC3T3-E1细胞中加入FGFR1抑制剂后，其MTT水平显著降低，处于DNA合成期(S期)的细胞比例明显降低，而处于静止期(G1/G0)期的细胞比例明显升高，细胞增殖能力下降；但与之相反，其ALP活性显著提高，提示FGFR1抑制剂具有抑制MC3T3-E1增殖、促进其分化的作用，即FGFR1具有促进其增殖而抑制其分化的作用；以往研究表明，敲除FGFR1基因可增强成骨细胞的矿化能力，本实验结果与之相呼应[14]。此外，相比于单纯的抑制剂组，双因素处理组细胞的增殖活性受抑制程度更高，ALP活性水平增加也更为显著。综上，推测FGFR1具有促进成骨细胞增殖而抑制其分化的作用，且参与雌激素对成骨细胞增殖分化的调控过程。

成骨特异性转录因子(Runx2)和骨钙素(OCN)分别是成骨细胞分化的早期和晚期阶段的标志物[15,16]，常用来检测细胞的成骨分化水平。本实验采用W estern Blot技术检测MC3T3-E1细胞中Runx2和OCN的蛋白表达，结果显示：加入雌激素后，MC3T3-E1细胞中二者表达均显著增高；在FGFR1抑制剂作用下，二者表达亦显著增高；且双因素处理组，增加幅度最大。由此，推测FGFR1能抑制成骨细胞的分化，且参与雌激素对成骨细胞分化的调控。

MAPK级联信号通路处于胞内众多信号通路的中心位置，且在细胞对外界刺激的适应性反应过程中发挥重要作用[17]，有研究表明，MAPK级联信号通路是雌激素对成骨细胞增殖分化调控过程中的关键环节[18,19]。本实验中，MC3T3-E1细胞在雌激素作用下，MAPK级联信号通路中ERK、JNK、P38三种关键因子的总蛋白表达量无明显差异，但其磷酸化水平均显著增高(P<0.05)。由此推断，MAPK级联信号通路中的ERK、JNK和P38通路均参与了雌激素对成骨细胞分化的调控过程。

Danu能够导致HepG2细胞出现G2/M周期阻滞和异倍体，呈浓度和时间依赖。Danu作用细胞24 h后，0.1 μmol组及 0.5 μmol组 G2/M 期细胞比例分别为58.2%和66.5%，异倍体比例分别为51.9%和44.5%，显著高于对照组（图2）。0.5 μmol Danu作用时间超过4 h后，G2/M期细胞及异倍体比例逐渐升高，和对照组相比，均具有统计学意义（图3）。

FGFR1是MAPK信号通路接受胞外信号的关键因子，与配体结合发生磷酸化后，可通过多种接头蛋白进而激活MAPK信号通路[7]。然而，本实验中加入FGFR1抑制剂后，抑制剂组与相同条件下无FGFR1抑制剂组相比，JNK和P38磷酸化水平无明显改变，仅ERK磷酸化水平明显增高，且雌激素作用下，升高更为明显。说明在MAPK级联信号通路中，仅ERK通路在FGFR1调控成骨细胞增殖分化的过程中发挥作用，且参与了雌激素对成骨细胞分化的调控。既往研究表明，ERK 1/2通路可抑制非编码MicroRNA-miR-133的表达，而m iR-133对FGFR1具有转录水平的抑制作用，二者之间可能存在反馈调节机制[20]。由此推测，MC3T3-E1细胞在FGFR1抑制剂作用下，ERK磷酸化水平升高，可与ERK信号通路在感受到FGFR1水平降低后，反馈性激活以代偿性增加FGFR1有关，同时ERK通路磷酸化水平升高又起到促成骨细胞分化的作用。

综上所述，本实验结果提示：FGFR1能促进MC3T3-E1细胞增殖，抑制其成骨分化，且参与雌激素对MC3T3-E1细胞增殖分化的调控。而MAPK级联信号通路中仅ERK通路磷酸化激活，参与上述过程。此外，FGFR1在成骨细胞对雌激素应答反应中的其他调控机制有待于进一步研究。

参考文献

[1] Song L,Zhao J,Zhang X,et al.Icariin induces osteob last proliferation,differentiation and mineralization th rough estrogen recep tor-mediated ERK and JNK signal activation[J].Eur JPharmacol,2013,714(1-3):15-22

[2] 于书娟，黄小艳，王彩虹，等.低浓度雌二醇对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞增殖分化能力的影响[J].口腔颌面修复学杂志，2016，17(1):17-21

[3] Shalhoub V,Ward S C,Sun B,et al.Fibroblast Grow th Factor 23(FGF23)and Alpha-Klotho Stimu late Osteob lastic MC3T3.E1 Cell Proliferation and Inhibit Mineralization[J].Calcif Tissue Int,2011,89(2):140-150

[4] Jacob A,Smith C,Partanen J,et al.Fibrob last grow th factor receptor 1 signaling in theosteo-chondrogenic cell lineage regulatessequentialsteps of osteoblastmaturation[J].Dev Biol,2006,296(2):315

[5] Ram an M,Chen W,Cobb M H.Differential regulation and properties of MAPKs[J].Oncogene,2007,26(22):3100-3112

[6] Pim ienta G,Pascual J.Canonicaland alternative MAPK signaling[J].CellCycle,2007,6(21):2628-2632

[7] MiraouiH,Marie P J.Fibroblast grow th factor receptor signaling crosstalk in skeletogenesis[J].SciSignal,2010,3(146):re9

[8] Shang Z Z,Li X,Sun H Q,et al.Differentially expressed genes and signalling pathways are involved in mouse osteoblast-like MC3T3-E1 cells exposed to 17-βestradiol[J].Int JOralSci,2014,6(3):142-149

[9] 王春先，周 磊，周东风，等.雌激素对大鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响[J].口腔颌面修复学杂志，2005，6(4):246-248

[10] 李传洁,李亚男.雌激素通过信号通路对成骨细胞分化、成熟与凋亡的调控[J].口腔颌面修复学杂志，2013，14(6):361-365

[11] 戚孟春，周秀青，刘 猛，等.雌激素对骨质疏松时种植体骨愈合的影响:Ⅱ骨计量学和电镜观察[J].中国口腔种植学杂志，2002，(3):104-107

[12] Bjerre L,Bünger C E,Kassem M,et al.Flow perfusion culture of human mesenchym al stem cellson silicate-substituted tricalcium phosphatescaffolds[J].Biom aterials,2008,29(17):2616-2627

[13] 商思霞，尹琳琳，孙惠强，等.流体剪切力与17-p雌二醇对MC3T3-E1细胞增殖活性协同作用的研究[J].华西口腔医学杂志，2013，31(l):61-64

[14] LiC Y,JeeW SS,Chen JL,et al.Estrogen and"Exercise"Have a Synergistic Effect in Preventing Bone Loss in the Lumbar Vertebra and Femoral Neck of the Ovariectomized Rat[J].Calcif Tissue Int,2003,72(1):42-49

[15] Chi Z.Transcrip tional regulation of bone formation by the osteob last-specific transcription factor Osx[J].JOrthop Res,2010,5(1):37

[16] Otto F,Kanegane H,Mundlos S.Mutations in the RUNX2 gene in patients with cleidocranial dysplasia[J].Hum Mutat,2002,19(3):209-216

[17] Chang L,Karin M.Mamm alian MAP kinase signalling cascades[J].Nature,2001,410(6824):37-40

[18] Song L,Zhao J,Zhang X,et al.Icariin induces osteob last proliferation,differentiation and m ineralization th rough estrogen receptor-mediated ERK and JNK signalactivation[J].Eur JPharmacol,2013,714(1-3):15-22

[19] Chiuan-Ren Y,Jeng-Jiann C,Chih-I L,et al.Estrogen Augments Shear Stress-Induced Signaling and Gene Exp ression in Osteoblast-like Cells via Estrogen Recep tor-Mediated Expression of β1-Integrin[J].JBone Miner Res,2010,25(3):627

[20] Feng Y,Niu L L,WeiW,et al.A feedback circuit between miR-133 and the ERK 1/2 pathway involving an exquisite mechanism for regulating myob last proliferation and differentiation[J].Cell Death Dis,2013,4(11):e934