种植体骨结合(osseointegration)是人工种植牙前临床应用研究中最重要、最关键环节，组织学切片观察被认为是种植体骨结合能力评价的“金标准”[1,2]。多种动物如犬、绵羊、山羊、小型猪、兔及大鼠均用于种植体骨结合研究的模型动物，动物的骨密度、骨骼大小成分、骨改建速率等与人体迥异，同一动物不同部位骨组织代谢也有所不同，种植体骨结合研究结果也不相同[2-4]。一般认为种植体植入颌骨的骨结合率高于植入股骨的骨结合率，但也有发现钛种植体和锆种植体植入绵羊股骨3个月骨结合率均显著高于植入下颌骨者[3]。因此，模型动物及植入部位的选择对实验结果的可靠性具有重要影响。本课题组利用金属钽优异的生物相容性、生物活性、耐腐蚀性等特性，制备了新型钛基钽涂层人工种植体，前期已完成了其体外理化、细胞相容性等系列研究[5-7]，为进一步研究种植体骨结合能力，本实验对比研究了钛基钽涂层人工种植体植入犬不同部位种植体骨结合情况，为种植体模型动物及植入部位选择提供参考，也为后续钛基钽涂层人工种植体前临床应用研究奠定基础。

通过验收测试的机器人丁达向喵星飞鼠大使提出了释放幽之谷居民的请求，而喵星飞鼠大使则用影态狙击枪扫射居民，以警告丁达不要有非分之想。镜心羽衣怒不可遏，命令丁达一脚踹掉喵星飞鼠大使的枪械。飞鼠群见状，开始疯狂报复。壶天晓为了给丁达争取恢复战斗力的时间，与飞鼠展开了激烈的正面对决。喵星飞鼠大使用大口径超级狙击枪，掳来壶天晓和镜心羽衣的队友当人质。镜心羽衣陷入深深的自责中。

1.材料和方法

1.1 主要材料和仪器 直径为4.3mm，长6mm的新型钛钽人工种植体40颗，由本课题组合作单位华南理工大学国家人体组织功能重建工程技术研究中心提供。钛钽人工种植体专用配套手术工具盒(由本课题合作单位北京西格东方医疗电子技术有限公司设计制造并提供)。ICH IROPRO光纤种植机(Bien air，瑞士)。硬组织切片机(Tissue Surgeon，德国)，M icro-CT机(S-3500，日本)，牙科用X线片机(西门子，德国)，牙科锥形束CT(New Tom,西门子，德国)，ImageJ图像采集系统(奥林巴斯，日本)。超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)。

首先，案例必须典型与真实，选取的每个案例都要具有代表性。在基础护理学实验教学中所采用的案例，均由临床真实案例改编而成。其次，案例要具有针对性与目的性，选择的病案必须符合该项护理操作的教学及临床护理工作要求，并能够反映该项护理操作的要点。

1.2 实验动物 选取健康1-2岁比格犬5只(体重5-6kg)，雌性，由解放军总医院动物实验中心提供(合格证号：NO.11400600001524，许可证号：SCKK(京)2016-0001)。动物实验方案经解放军总医院伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 材料准备 新型钛钽人工种植体，丙酮、去离子水分别超声清洗10m in，自然晾干后单个密封，60Co照射30m in灭菌，备用。

2.4 亚甲基蓝-酸性品红染色 亚甲基蓝-酸性品红染色组织学(图4)显示：成熟骨组织呈粉红染色，骨改建活跃的新生骨组织呈桃红染色，两组种植体与骨结合良好。植体末端分别进入下颌神经管和骨髓腔内，周围空虚无骨组织环绕。颌骨组(图4A)植体-骨界面上部可见狭小间隙，中部种植体-骨界面结合紧密、无缝隙，近种植体侧的骨组织侧有带状深红染色的新骨形成，新骨与远植体侧固有成熟骨之间有明显界限，呈条带状，宽窄不等。高倍镜下(图4C)见植体除上端与骨之间有少量结缔组织缝隙外，其余与骨结合区植体-骨密合，无间隙。红色深染区可见正在分泌的成骨细胞、大小不等的骨陷窝，陷窝内有核蓝染的骨细胞；股骨组(图4B)种植体与骨局部结合良好，亦可见片状红色深染的新骨形成，与远植体侧的成熟骨组织界限不清，但植体与骨组织间有纤维结缔组织间隙。高倍镜下(图4D)见深色红染的骨基质中有骨陷窝、骨细胞及正在分泌的成骨细胞，植体骨界面可见结缔组织间隙。股骨皮质骨较颌骨皮质骨薄，与植体结合面积明显较少，骨髓腔大，内有血管，内有红细胞。

（一）资源基础与新疆农产品区域品牌竞争力的关系。农产品区域品牌资源基础包括自然资源、社会资源、人力资源以及资源开发利用情况等几方面[12]。独特的自然资源是农产品区域品牌形成的物质基础和根本原因，自然资源独特加之社会和人力资源的有效配置，往往有利于知名品牌的形成[11]。因此，本文结合新疆农产品资源优势，提出如下假设：

植入手术：术前拍摄CBCT，确定植体长度、直径及植入方向。手术步骤简述如下：(1)颌骨植入：实验犬常规麻醉、拍片检查、消毒、铺巾。下颌缺牙区牙槽嵴顶做切口，切开、翻瓣，定位2颗种植体植入位点，逐级预备种植窝至预定深度及直径，植入4.3×6mm种植体2枚。同法完成对侧种植体植入。(2)股骨植入：常规备皮、消毒、铺巾，股骨上端距股骨头约2cm做切口，切开皮肤，分离，显露股骨，股骨干垢端骨皮质表面定位，生理盐水持续冲洗冷却下逐级制备4.3×6mm种植床，低速缓慢分别植入钛钽种植体，关闭创口，术后医嘱同前。

2.3 Micro-CT平扫 Micro-CT矢状面扫描显示，两组骨内植入体均呈极高密度金属阻射影像，植体螺纹呈齿状嵌入较高密度的骨内，种植体-骨界面上段结合紧密，颌骨组中下段未见低密度间隙及阴影，股骨组中下段近骨髓腔处种植体周空虚(图2)。两组植体下端分别伸入低密度下颌神经管和骨髓腔内。BMD分析显示：颌骨组BMD为1169±86.39mg/cc，股骨组 BMD 754.2±129.4mg/cc，两组BMD比较结果具有统计学差异(P＜0.05)(图3)。

α1(t)=α2(t)=0.55+0.05cos(2 t)，令通过计算可知该系统满足定理3.3和定理4.1的条件，则该系统是持久的，并且存在唯一的正的一致渐近稳定的概周期解.

1.3.6 ImageJ图像分析 采用ImageJ软件分析带植体硬组织切片图像中新骨形成面积。每张图像随机选取10个视野，三色法染色成熟骨染为天蓝色，新生未完全钙化骨染为玫瑰红色，纤维结缔组织则为橘黄色。ImageJ软件可调整色调(Hue)选取玫瑰红色新骨，并计算新骨形成面积。具体方法如下：显微镜图像采集标尺(Bar)为100μm；Rectangular工具分别选取种植体及周围新骨和部分成熟骨；Image/Ad just/Color Th reshold/Hue/Select在HSB模式下调整Hue来选取代表新骨形成面积的红色区域，计算面积。每个植体制5个切片，取红色测量结果均值为植体周新骨形成面积，蓝色代表种植体周围成熟新骨组织。

2.5 Goldner三色法染色 Goldner三色法染色特点是骨组织成熟程度不同，其显示颜色也不同，成熟骨染为天蓝色，新生未完全钙化骨染为玫瑰红色，纤维结缔组织则为橘黄色。本组结果(图5)显示，颌骨组(图5A、C)植体-骨界面新形成的骨组织呈带状深红染色，与蓝色染色的成熟骨组织间有移行，但界限较为清楚，新骨呈指状突入植体的螺纹之间，红染的新骨与黑染的植体之间紧密结合，无缝隙，红染的新骨与蓝染的成熟骨组织内有大小不等的骨陷窝。股骨组(图5B、D)红染的新骨组织条带较颌骨组窄，沿植体螺纹呈波浪状排列，蓝色染色的成熟骨深红染色的新骨间夹杂橘黄染色的纤维结缔组织，局部有红黄相间之表现，亦可见大小不等的骨陷窝。ImageJ软件半定量分析两组骨环绕区新骨形成面积，结果显示(图6)：颌骨组新骨形成面积为294.4±10.18μm2，股骨组新骨形成面积是108.4±3.208μm2，两组有显著性差别(P＜0.01)。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS22.0软件进行统计学分析。Micro-CT用Micro View软件进行数据采集，BMD分析。ImageJ软件分析组织学切片新骨形成面积。两组数据经验证符合正态分布，且方差齐性，结果均采用采用独立样本t检验，设P<0.05为有统计学差异(双侧)。

2.结果

2.1 大体观察 观察期间5条犬均存活，精神好，创口愈合良好，无感染、裂开。两个部位植入的种植体均稳固，无松动、脱落。颌骨与股骨种植体周围软组织色、形、质正常。

2.2 X线牙片检查 X线牙片显示，下颌骨缺牙区植入的种植体，呈柱状极高密度金属阻射影像，中下段可见螺纹，螺纹间充满与周围密度相同的骨组织，植体尖部进入低密度的下颌神经管内；股骨植入区的植体周骨密度明显高于颌骨组织，螺纹清楚。两组种植体周均未见低密度间隙或阴影(图1)。

1.3.3 分组及种植体植入 分组：分为颌骨植入组和股骨植入组两组。颌骨组每侧缺牙区分别植入2颗钛钽人工种植，股骨组每侧股骨分别植入2颗钛钽种植体(见图1)。每只犬双侧颌骨和股骨共植入8颗植体，5只比格犬共植入40颗人工种植体。

  

图1 钛钽人工种植体植入犬体内3个月X线检查结果

1.3.4 放射影像学检查 钛钽人工种植体植入后3个月取材，制作组织学切片标本。过量麻药处死犬，分离人工种植体-骨标本，福尔马林固定48h后盐水反复冲洗，X-ray检查定位并行Micro-CT扫描。

1.3.5 组织学检查 犬颌骨、股骨植入区取材。不脱钙硬组织切片标本制备要求准备[8,9]。完整截取带种植体颌骨及股骨组织，切割制备成含单个种植体的骨标本，修整至约2.5cm×1.5cm×1.5cm大小的组织块，立即以4%多聚甲醛固定48h。参照下颌骨/股骨-种植体不脱钙硬骨磨片技术制作，要点简述如下：分切固定标本至大小约5×10×15mm3，冲洗、脱水、环氧树脂浸润、包埋、制作磨片，亚甲基蓝-酸性品红染色，方法如下：亚甲基蓝染液，60℃水浴染色15m in，漂洗、干燥，酸性品红染液染色5m in，弃去，梯度乙醇脱水、封片、观察。Goldner三色法染色方法：①磨片脱塑至水，W eigert’s铁苏木素液15m in，漂洗；②丽春红－酸性品红液15m in，1%醋酸液漂洗2次，下同；-磷钨酸－桔黄G液8m in，漂洗；-亮绿液15m in，漂洗2次，70%-100%乙醇脱水，封片。

译者将“My dear Mr.Bennet”译为“我的好老爷[4]”，显然他沿用了十八世纪时候中国女性对丈夫的尊称。而事实上，Jane Austen同时期时候的欧洲女性已享有较高的社会地位，妻子不会像当时的中国女性称呼自己的丈夫为“老爷”，因此将“My dear Mr.Bennet”译为“亲爱的贝内特先生”更为恰当。

  

图2 钛钽种植体植入犬体内3个月Micro-CT扫描结果

  

图3 钛钽种植体植入犬体内3个月Micro-CT扫描BMD分析

1.3.2 犬缺牙模型建立 犬常规术前准备，30g/L戊巴比妥钠(1m L/kg体重)气管插管，静脉麻醉。显效后侧卧位。分根拔除双侧下颌第一磨牙，缝合创口。术后软食一周，肌注青霉素80万U，2次/天，连续3天，7天拆线。拔牙后3个月，口内检查及拍牙片、CBCT种植测量分析，显示建模成功。

  

图4 钛钽种植体植入犬骨内3个月带植体骨组织学观察(亚甲蓝-酸性品红染色)

 

A、C：颌骨；B、D：股骨(AB：X10；CD：X25)NB：新生骨；B成熟骨：Ta：钛钽植体；BMC：骨髓腔；MC：下颌神经管

1.3.7 骨密度计量分析 选取实际的植入角度以及植入体对CT影像的干扰最小化原则，利用GEHC Micro View软件，在种植体的颊侧、舌侧、近中、远中选取四处影像条件种植体体部螺纹间距分配一长、宽、高各为0.4cm的圆柱状选区(region of interest，ROI)，分别测量种植体周骨密度(bone mineral density，BMD)，取其均值为种植体周围骨密度，依照此法分别测量颌骨和股骨种植体周围BMD，统计学分析[10]。

  

图5 钛钽人工种植体植入犬体内3月组织学观察(Goldner's三色法染色)

 

A、C：颌骨；B、D：股骨(A、B：×10；CD：×25)

  

图6 钛钽人工种植体植入犬体内3月种植体周新骨形成面积比较(三色法染色)

3.讨论

在种植体及其表面处理对种植体骨结合影响研究的动物实验中，有植入动物胫骨、股骨上段、股骨下段及上颌窦区，不同骨植入部位对种植体骨结合的影响并不相同。Siddiqi等[11]将喷砂处理氧化钇稳定的二氧化锆种植体和喷砂酸蚀处理的钛种植体分别植入绵羊下颌骨和股骨，未负重情况下12周取材组织学切片，骨形态计量分析种植体骨结合率(bone-to-implantcontact，BIC%)，结果发现氧化锆种植体与股骨和颌骨的骨结合率分别为85.5%和72.2%，而对照组钛种植体与股骨和颌骨的骨结合率分别为78.9%和60.3%，两类种植体的与股骨的骨结合率显著高于颌骨。然而本研究的结论与之相反，将钛基钽涂层人工种植体分别植入犬下颌骨和股骨，3个月无论是Micro-CT骨密度分析还是组织学切片三色法染色，结果均显示植入颌骨组均高于股骨组。分析两项研究发现，不同部位骨结构和重建能力不同，如小梁松质骨和致密的皮质骨，骨结合能力并不相同。股骨皮质骨厚且致密，松质骨比例较低，种植体骨接触率高，而下颌骨因皮质骨较薄且内部松质骨比例较高，海绵状的松质骨骨小梁与种植体接触率低，因而，出现股骨BIC%高于颌骨BIC%的结果。另外，Siddiqi采用的一段式人工种植体，早期基台暴露在口腔环境中的颌骨内种植体，咀嚼运动会对种植体初期稳定性及骨结合造成影响[12]，而股骨内植入种植体后创口关闭，愈合期干扰因素较少，因而出现股骨较颌骨BIC%高的情况。而本研究中，1-2岁犬处于青年期，股骨中上段皮质骨较薄呈拱状，与内部骨小梁形成致密坚固的网络结构，而犬下颌骨皮质骨厚，内部松质骨比例不高。这表明动物的年龄、骨类型、结构都不同程度影响植入其中的种植体骨结合能力。

股骨和下颌骨发育来源、骨形成方式不同，这可能是其与植体成骨活性不同的主要原因。从胚胎发育的角度来看，颌骨来源于神经外胚层的神经嵴细胞，在神经嵴细胞迁移分化过程中，所产生的生长因子和相关信号通路引导神经嵴细胞通过膜内成骨形成颅面结构[13]。而躯干骨和四肢骨则来源于中胚层的间叶细胞，骨的形成是软骨内成骨过程。多项研究表明，这些起源不同的骨组织其改建及对外界刺激信号的反应也有所不同。Mavropou los[14]发现：在卵巢切除术后或营养失调的情况下，颌骨流失了骨组织明显较胫骨少。但在某些骨骼疾病中，如牙周病、甲状旁腺功能亢进-颌骨肿瘤综合征、巨颌症、颌骨二磷酸盐相关的骨坏死，颌骨的受累程度明显要高于长骨[15-17]。以上均提示颌骨和长骨有着不同的体内平衡机制。此外，以颌骨作为供体的移植修复颌面部缺损往往能取得更高的成功率，这也提示颌骨来源的自体骨更能刺激新骨的形成[18,19]。

不同来源和结构的股骨和下颌骨对不同刺激的反应不同是有其深在的细胞和分子学基础的。研究发现颌骨与长骨的骨髓间充质干细胞在增殖分化和成骨能力方面的确存在显著差异。这种差异可能是影响种植体骨结合的因素。Aghaloo等取小鼠的颌骨骨髓间充质干细胞(BMSCs)与胫骨的骨髓间充质干细胞(BMSCs)-培养[20]，发现颌骨BMSCs生成更多的细胞集落，Von Kossa硝酸银法染色显示颌骨BMSCs生成的矿化结节比胫骨多70%，并且颌骨BMSCs的ALP活性较胫骨BMSCs显著增强。为进一步明确两者的成骨分化潜能差异，采用实时PCR检测发现颌骨BMSCs的ALP和OC相关基因的表达较胫骨BMSCs显著增强。同样Akintoye等[21,22]将人的上、下颌骨骨髓间充质干细胞(OFBMSCs)及髂骨嵴的骨髓间充质干细胞(IC-BMSCs)进行体、内外对比分析，通过细胞的生长曲线、Western blot和实时PCR技术检测与细胞增殖相关端粒酶基因及产物及矿化相关检测，结果表明：OF-BMSCs具有更强的增殖活性，将同等数量的OF-BMSCs和IC-BMSCs在相同条件下培养，OFBMSCs的群体倍增数(population doubling PD)为180，而IC-BMSCs为40，另外，OF-BMSCs较IC-BMSCs更不易衰老，端粒酶活性较IC-BMSCs显著增强。对OF-BMSCs和IC-BMSCs成骨诱导也发现，OF-BMSCs在第4周便观察到矿化结节的形成，而髂骨BMSCs在第12周才观察到矿化结节，且OF-BMSCs形成矿化结节的数量较髂骨BMSCs显著增多。进一步分别将OF-BMSCs及髂骨的BMSCs复合羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料植入裸鼠体内，4、6、10、12周取材组织学观察，对比分析表明：OF-BMSCs组形成独立的含骨小梁的网状结构的矿化成熟骨(或类骨质)，髂骨BMSCs形成彼此紧密相连团块状骨块，其中富含骨髓和结缔组织，这些研究表明，神经外胚层来源的颌骨BMSCs与中胚层来源的躯干四肢骨其细胞及分子生物学基础其实是有很大差别的，对外界的刺激反应的分子机理也不尽相同。

颌骨和股骨内红、黄骨髓的分布随着年龄的改变会对种植体的骨结合造成一定的影响。本实验应用的比格犬为2岁的成年小型犬，犬的颌骨为中轴骨，终生含红骨髓，红骨髓血运丰富，含有较多的骨髓间充质干细胞；而股骨随着年龄的增加，成年后干骺端同时含有红黄骨髓，其余部分为黄骨髓，黄骨髓的主要成分为脂肪，毛细血管的数量较少，直径较红骨髓血窦细[23]。颌骨的红骨髓血运丰富、富含骨髓间充质干细胞，而成年比格犬股骨干处多为黄骨髓。这也从另一方面说明，颌骨较股骨具有更强的修复改建功能，从而出现本研究中颌骨与股骨对种植体骨结合的差异。

将钛基钽涂层人工种植体植入不同部位骨结合能力的实验中，采用两种不脱钙种植体-骨染色方法：亚甲基蓝-酸性品红染色、Goldner三色法染色，分别从植体周围成骨情况和新骨形成的过程这两个角度来更直观形象的分析新型钛基钽涂层种植体的骨结合情况。结果不仅观察到种植体骨结合能力，而且通过三色法新骨与成熟骨截然不同的颜色，通过分析软件量化比较新骨形成面积，更清楚显示两者成骨能力之不同。关于这种差别的分子机理及钛基钽涂层人工种植体与钛种植体、羟基磷灰石涂层种植体植入颌骨的种植体骨结合能力对比研究，本课题组拟开展进一步探讨。

艺兴公司业务部主要负责广告费和房屋租赁费的收取和催缴工作；法务部负责合同书的拟定和保管等工作，同时承担稽核工作。由于法务部人员少，且人员专业素质不高，稽核岗位形同虚设，未很好的履行稽核工作；主要领导对内部控制重视不够，未建立合理的内部控制体系，该公司内部环境比较差。

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