乳腺癌是严重威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤，尽管现有的研究已经取得一定进展，其发病率和死亡率仍逐年上升［1⁃3］。在乳腺癌中，HER⁃2基因的表达与肿瘤的侵袭转移、预后和整体生存率密切相关［4⁃7］，对于接受传统的化疗与内分泌治疗方法耐受或耐药的患者［8⁃9］，针对 HER⁃2 基因的靶向药物赫赛汀（Herceptin）更是为其治疗提供了新思路。研究表明20%～30%的浸润性乳腺癌患者尤其是浸润性导管癌患者中发现HER⁃2基因的扩增和/或 HER⁃2 蛋白的过表达［10⁃11］，因此正确检测和评价乳腺癌HER⁃2状态至关重要。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administra⁃tion，FDA）准许临床上进行HER⁃2检测的荧光原位杂交（fluoresecence in situ hybridization，FISH）检测用于检查17号染色体着丝粒（CEP17）和HER⁃2基因扩增情况，FISH的敏感性和特异性较高，是目前国际公认的 HER⁃2 基因检测的“金标准”［10］。

开展HER⁃2室间质控的目的是为了实现各检测实验室对同一病例检测结果保持一致性和可重复性，进而反映患者HER⁃2基因的真实表达情况。乳腺癌靶向药物赫赛汀主要应用于HER⁃2基因过表达的乳腺癌患者，因此患者用药前必须测定肿瘤组织中的HER⁃2基因状态，只有通过严格的标准化检测，乳腺癌患者的靶向治疗才能达到最佳效果。

广东省的三甲医院已相继运用FISH技术开展临床上乳腺癌HER⁃2基因的检测，为了对我省HER⁃2基因检测的基本情况进行摸底，发现和解决各实验室检测中存在的共性及个性的问题，保证不同实验室间检测的一致性，广东省病理质控中心2015年6月举行了广东省HER⁃2室间质控项目（external quality assessment，EQA），对我省广州、深圳、汕头等市的26家医院及检测机构进行了评估，本文将对本次质控的情况及存在的问题进行总结。

1 材料与方法

1.1 材料

此次质控使用的样本为甲醛固定的乳腺癌石蜡包埋的手术样本，选择HER⁃2不同阳性模式的石蜡切片作为质控片标本，共设立3个质控品，样本①、②为HER⁃2基因扩增阳性样本，样本③为HER⁃2基因扩增阴性样本。此次供片单位分别为中山大学附属第一医院、中山大学附属肿瘤医院、广东省中医院3家单位。每家供片单位提供1个样本，该样本提供90张切片，切片厚度均为3～5 μm，保证参与质控的各实验室每个样本有3张玻片，一张用于组织学染色，一张用于HER⁃2检测，一张备用，供片单位将同一病例的首尾2张各做FISH检测以确保质控片质量的一致性。供片单位于质控活动正式开展15日前将切片及参考结果上交广东省临床病理医疗质量控制中心分子病理质控小组，供片单位提供的质控品在发放前需由一家分子病理质控小组成员确定的医院再次检测验证。质控结果由质控小组成员采取双盲形式进行结果判读。质控样本统一寄发给各参与实验室，每家参评单位在收到质控玻片一个月内完成检测后，将“室间质评活动回报表”和检测的原始玻片在低温状态下快递邮寄到省临床病理医疗质量控制中心，质评成绩在实验室上报结果2周后下发。

“签约！”一家来自陕西的民营企业在此次博览会上与来自德国、瑞典、瑞士等国家的国际一流品牌设备供应商签订累计逾1.4亿元人民币的采购协议。“如果说民营企业座谈会让我们吃下了定心丸，那么进博会又给了我们一个大舞台。”小红书合伙人曾秀莲坦言。此次进博会上，上海交易团组建了四大采购商联盟（跨境进口电商联盟、大型零售商联盟、综合贸易服务商联盟和展示展销服务联盟）累计达成意向采购金额40亿元人民币。

本次参控单位使用的检测试剂共有雅培（美国）、北京金菩嘉医疗科技有限公司、广州安必平医药科技股份有限公司3家公司的试剂，从汇报的结果看，3种试剂探针本身对质控结果的影响无明显差异。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

本次质控中，消化液使用了胃蛋白酶和蛋白酶K 2种消化酶，12家使用了蛋白酶K，其中11家使用的蛋白酶K浓度为200 μg/mL，消化时间为0.5～19 min，1家医院使用的蛋白酶K浓度为150 μg/mL，消化时间为10 min。14家使用了胃蛋白酶，浓度为4 mg/mL，消化时间为5～40 min。通过镜下观察信号杂交情况，2种酶的消化效果无特别明显差异。

1.2.2 判读标准

FISH技术操作中影响染色质量的因素较多，如果实验过程中操作不当会严重影响最终染色结果，因此只有准确地检测HER⁃2基因的表达才能确保患者可以从靶向治疗中获益。笔者结合本次质控中存在的问题及实验室在实际检验中的情况，针对在FISH操作过程中一些关键操作步骤进行探讨。

1.2.3 质评考核参数

根据各参评单位上交的资料，质控小组各成员从检测试剂的种类、消化液种类、消化液的浓度及消化时间、红绿信号比值、检测玻片的背景及信号强度、浸润癌所占的细胞比例、玻片是否水煮及水煮时间、变性及杂交的温度及时间、是否有异质性等参数进行结果评定。

2 结果

2.1 检测试剂种类

①污水处理工程。全市已建成生活污水处理厂5处，实现了辖区内县城都有污水处理厂的目标。晋城市污水处理厂日处理污水能力7.5万t，形成的中水用于西河百丽园、白马寺山森林公园、泽州公园、花园头水库等河道景观生态用水，以及道路喷洒、园林绿化用水，并满足国投晋城热电厂一期生产用水。阳城县污水处理厂日处理污水能力1.8万t，1万t中水用于2×135 MW电厂及建瓷工业园区用水。高平市与山西国际能源公司合资污水处理厂日处理污水能力3万t，用于2×600 MW电厂用水和园林绿化、丹河河道景观用水。这些污水处理回用工程的密集投入运行，使全市污水处理回用率达到37.6%，远超30%的三年规划预期指标。

2.2 消化液种类及时间

本次质控各实验室采用荧光原位杂交（FISH）检测方法。基本程序包括组织切片、脱蜡至水化、预处理、酶消化、脱水、变性和杂交、洗涤复染、复染阅片。操作流程按照每家单位临床检测的标准操作程序（standard operating procedure，SOP）进行。主要步骤如下：室温下进行组织切片，切片厚度为4 μm；100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇梯度酒精进行脱水，然后将玻片放至去离子水中；将玻片放入（95±5）℃的去离子水中煮片20～30 min或者将玻片放入80℃的预处理试剂中，恒温处理10 min；将组织切片用蛋白酶K或胃蛋白酶工作液中浸泡或滴染消化；依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中进行脱水；自然干燥或置45～50℃烤片机上干燥玻片，加探针后盖上盖玻片并用封片胶密封后放于原位杂交仪中变性杂交，也可利用水浴箱等设定好的温度条件进行人工变性杂交，变性温度一般为73～83℃，变性5 min，杂交温度为37℃或42℃，杂交时间16～20 h；杂交完成后移去盖玻片，按照试剂盒说明书中要求的NP40及2×SSC的浓度进行杂交后洗涤；70%乙醇处理 5 min，玻片自然干燥后滴加 4′，6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚（4′，6⁃diamidino⁃2⁃phenylindole，DAPI）复染封片，避光荧光显微镜下进行阅片。

2.3 其它参数情况

26家参评单位，除3家未采用水煮的处理方式之外，其余23家均进行了水煮的步骤，水煮时间17～30 min，其中1家用EDTA修复液进行水煮，其余均采用双蒸水水煮。总体变性温度为73～85℃，变性时间 5～8 min；杂交温度 37～42℃，杂交时间12～20 h。在本次质控中，标本①有2家医院的检测报告中提及标本存在肿瘤异质性问题，标本②有1家医院检测报告提及异质性问题。

2.4 结果吻合率

在荧光显微镜下观察26家参评单位的玻片，DAPI通道下观察轮廓消化过度的有2家，红色信号强度较弱有2家，绿色信号强度较弱有1家。背景及信号强度结果不合格者与规范实例的典型对照如图4，该图像是使用OLYMPUS BX51荧光显微镜在100×油镜下观察FISH检测的玻片后采集并合成的。参评单位中有2家单位DAPI轮廓显示不清，甚至可见红色与绿色信号定位于细胞外（图4A1，4A2）。红色信号强度较弱者2家（图4B1，4B2），绿色信号强度较弱者 1 家（图 4C1，4C2），通过改进和完善制片方法可以避免类似结果发生。

图1 各参评实验室标本①的HER⁃2/CEP17比值情况 Figure 1 The HER⁃2/CEP17 ratio of specimen ① in each participating laboratory

2.5 背景及信号强度

乳腺癌标本①结果吻合率96.15%，HER⁃2/CEP17比值介于 3.29～8.52，HER⁃2/CEP17平均值为4.12（图1），有1家单位结果报成簇状扩增，镜下观察其玻片的红色背景下存在非特异杂交信号，簇状扩增应为误判；乳腺癌标本②结果吻合率84.62%，4家实验室报点扩增，HER⁃2/CEP17比值介于7.49～10.27，其余实验室均报HER⁃2基因红色信号点成簇（图2）；标本③结果吻合率100%。HER⁃2/CEP17 比值介于 1.00～1.79，HER⁃2/CEP17平均值为1.18（图3）。

绿色经济发展是一个动态的过程，其效应需要一定的时间才能反映出来。因此，指标的选择要充分考虑到动态变化特点，选取多年数据进行动态分析。

这位“Ian·斯坦·戴”在酒圈里是出了名的好玩。十一年前从澳洲辍学回国自学葡萄酒，后来当过侍酒师，担任过葡萄酒大赛项目的总策划，翻译过几本葡萄酒书籍，给亚马逊做全球葡萄酒直采……到2017年，他跟几位同样年轻的小伙伴到贺兰山东麓创立了一个酒庄——小圃酿造。

3 讨论

图2 各参评实验室标本②的HER⁃2/CEP17比值情况 Figure 2 The HER⁃2/CEP17 ratio of specimen ② in each participating laboratory

图3 各参评实验室标本③的HER⁃2/CEP17比值情况 Figure 3 The HER⁃2/CEP17 ratio of specimen ③ in each participating laboratory

判读标准按照《乳腺癌HER⁃2检测指南（2014版）》，选择细胞核大小一致、核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中的双色信号，判读标准：①当HER⁃2/CEP17比值≥2.0时，为HER⁃2阳性；HER⁃2/CEP17比值＜2.0，但平均HER⁃2拷贝数/细胞≥6.0时也为HER⁃2阳性。②HER⁃2/CEPl7比值＜2.0且平均HER⁃2拷贝数/细胞＜4.0时为HER⁃2阴性。③HER⁃2/CEP17比值＜2.0且平均 HER⁃2拷贝数/细胞＜6.0，但 HER⁃2拷贝数/细胞＞4.0时HER⁃2 为结果不确定［12］。

FISH操作对组织的前期处理要求比较严格，要求标本尽量在离体0.5 h内用10%中性甲醛进行及时、有效的固定，由于甲醛可以使DNA或蛋白质的氨基团间形成亚甲基网桥，这种交联作用使细胞质或细胞核内的各种生物大分子形成网络，利于维持细胞结构和组织形态，但这样会影响细胞膜的通透性，阻碍核酸探针的掺入［13］。为了解石蜡组织标本经甲醛固定后蛋白质分子发生交联造成的抗原封闭问题，目前参加质评的各实验室采用了高温预处理的方法，常见的预处理的方式主要包括水煮法、硫氢化钠法、亚硫酸氢钠法等。在上述操作过程中水煮法最为简便易行，本次质控中88%的医院采用了水煮的处理方式，该步骤主要通过高温或化学处理消除甲醛固定所致的蛋白交联，水煮的液体可以是去离子水、超纯水或者双蒸馏水，时间一般为15～30 min。临床检测中，对于一些软组织肉瘤等类型的标本及一些抗原封闭严重不利于探针杂交的组织可以尝试用柠檬酸（pH 6.0）或EDTA（pH 9.0）抗原修复液进行煮沸或高压修复。在实际操作中应结合实验室使用的试剂盒、不同的组织标本及探针类型采取不同的处理方式来摸索合适的高温预处理条件。

图4 FISH背景及信号强度检测结果 Figure 4 FISH test of background and signal intensity results

A：DAPI轮廓；B：红色信号强度；C：绿色信号强度。其中，A1、B1、C1为消化严重过度，A2、B2、C2为消化过度，A3、B3、C3为消化适中。

在FISH操作中，为了增加组织的通透性，使探针更好地与组织内的DNA进行杂交，一般采用酶消化的方法以去掉包围靶核酸的蛋白质。之前研究报道，一般脱落细胞用胃蛋白酶消化，活检组织用蛋白酶K，且所有标本在摸索条件之前应该在显微镜下确定其标本和形态类型以便灵活掌握酶的消化程度［14］。但在实际操作中，也有很多试剂盒推荐用胃酶来消化组织，胃酶比较温和，用于消化组织也可以起到很好的效果。酶消化的时间会因酶种类的不同而有所改变，且由于标本固定、组织结构、性质不同，即便在相同的热水浴预处理、酶消化时间条件下，其组织细胞消化的程度也不一致，产生的背景荧光、信号荧光强度也不同，即信噪比也会不同［15］。此次质控中，由于各实验室酶的储存及效价不同，还有酶的消化方式不同，有些单位将玻片放入考普林瓶用浸泡法进行消化，有些单位将消化液滴在玻片的组织上进行消化，因此同种类且同浓度的酶在不同医院间存在消化时间上的差异。为避免本次质控中一些实验室出现消化过度的问题，可在玻片消化后置于荧光显微镜下的DAPI通道观察细胞核是否清晰完整来判定消化效果，如果消化不足，镜下细胞边缘呈云雾状，会影响杂交效率使信号降低甚至无法完成正常杂交造成无信号；但如果消化过度，镜下观察细胞核内出现空洞、核膜不完整甚至消失，引起靶核酸减少使杂交效率降低甚至无法杂交。

例如，教师在给学生讲解《鲸》的课文内容时，教师可以为学生制作多媒体动画，让学生欣赏鲸鱼的进化过程，了解更多的科学知识。教师再引导学生学习鲸鱼不是鱼的原因，启发学生进行学习和思考。然后，教师可以让学生简单概括鲸鱼的特点，然后再为学生拟定标题，让学生练习写科普类的作文，从而发展学生的科学修养，锻炼学生的写作能力。

乳腺癌是一种典型存在异质性的肿瘤，并且肿瘤的组织学和遗传特性都具有异质性［16⁃17］，因此，现有临床数据表明并不是所有的HER⁃2阳性患者都能从抗HER⁃2靶向治疗中获益［18］。肿瘤异质性是影响靶向药物疗效和复发的重要因素，靶向药物选择性杀伤依赖靶分子的肿瘤细胞，采用曲妥珠单抗治疗后，如果肿瘤主要由HER⁃2高表达的肿瘤这类型细胞组成，靶向药物杀灭大多数肿瘤细胞，获得较好的短期疗效，但不依赖此途径的肿瘤细胞则可能存活而逐渐形成耐药细胞群［19］。在日常检测中，为避免异质性的问题一定要规范地阅片，病理医生在对至少20个细胞计数之前应该扫描整张玻片，如果存在第二群细胞有更高的HER⁃2信号数/细胞，并且这群细胞由切片上超过10%的肿瘤细胞组成，应另对这群细胞中至少20个不重叠的细胞进行计数并报告，同时要对该群细胞占所有浸润性肿瘤细胞的比例进行报告［20］。此次质控中出现参评单位的结果存在对异质性的报告不统一、报告中红绿信号比例不同以及浸润癌占肿瘤细胞比例不同的问题，分析原因一方面是因为石蜡质控标本在连续切片过程中，随着切片数量的增加，组织中的肿瘤细胞含量及结构发生变化所致，一方面是该质控样本的确本身存在异质性问题，如选择不同区域阅片会存在差异。因此，在临床检测中，一旦发现肿瘤异质性，应规范地在报告中指出。

综上所述，要保证HER⁃2检测的准确性和可重复性，实验室应严格按照各实验室操作流程，保证染色过程中的温度、缓冲液及清洗液的浓度和pH值、探针的配制等参数准确，确保样本处理、各检测流程及判读等各个步骤均规范化操作，只有通过不断健全室间质控系统，科学设计基础与临床实验流程步骤和评价标准，配合孰知各项实验内容的检测团队，定期进行监查活动，才能确保临床乳腺癌HER⁃2基因的检测持续准确、可靠，从而更好地为临床诊疗服务。

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