肺癌是否发生转移对于术后的治疗方式和预后有重要的影响，但是目前缺乏可早期、动态监测肺癌转移的标志物。目前多项研究表明，抑癌基因—Ras相关结构域蛋白家族1A（ras association domain family 1A，RASSF1A）的编码基因启动子区的甲基化与肺癌相关［1⁃3］。因此 RASSF1A 基因甲基化有可能作为动态监测肺癌转移的标志物。同时，近几年对于循环肿瘤DNA的研究显示，肿瘤患者血液中游离DNA与相应的原发肿瘤细胞基因变异相一致［2］。因此，循环血中的RASSF1A基因甲基化水平检测也可能成为一种非侵入性的肿瘤诊断手段［3］。鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）是一种传统的肺癌标志物，可辅助诊断肺鳞癌，配合癌抗原125（cancer antigen 125，CA125）、细胞角蛋白19片段（cytoker⁃atin⁃19⁃fragment，CYFRA21⁃1）、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）联合检测可提高肺癌患者诊断的灵敏性［4］，其水平与肿瘤的进展程度相关，但是单独检测灵敏度不高［5⁃6］。本研究通过随访观察非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）患者，采用甲基化特异性PCR（methyla⁃tion specific PCR，MSP）技术对NSCLC患者肿瘤组织及对应术前血浆标本中RASSF1A甲基化水平进行检测，并同时检测上述病例术前血清SCC水平，旨在探讨RASSF1A甲基化水平和SCC联合检测在NSCLC患者危险分层及术后转移评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月至2015年6月在龙岩市第二医院就诊的57例NSCLC患者，其中男性25例，年龄35～72岁，平均年龄（65.8±3.9）岁；女性 32例，年龄 30～70岁，平均年龄（59.5±5.6）岁。入选标准：①病理诊断为NSCLC，符合美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）2015年 NSCLC临床指南［7］。②未经任何放化疗等治疗。③无其他肿瘤病史。

1.2 方法

在施行手术前采集患者外周静脉血液标本5 mL，其中2 mL分离血清，3 mL置于经过EDTA⁃Na处理的抗凝管中，3 000 r/min离心15 min，分离血浆。取5～10 g肿瘤组织，肿瘤组织需取自肿块中心且未发生坏死的部分，术后均经病理医生确诊为NSCLC。组织获取均征得患者及家属知情同意，并经医院伦理委员会同意，分别于1个月、3个月、6个月、12个月随访患者因肺癌转移再次入院情况。

1.2.1 血清SCC水平测定

血清SCC水平测定采用电化学发光法，试剂和检测仪器购自美国罗氏公司。实验步骤按照说明书操作。血清SCC水平正常值为：＜1.5 ng/mL。

翻转课堂作为新兴的教学模式，其实施必须要能真正激发学生自主学习的兴趣。翻转课堂不仅仅是对传统课堂的颠覆，也能使学生在课下有更多获取知识、自主思考的机会和渠道，更能使课堂上的时间被充分利用，让教学变得更具效率，照顾到更多的学生。但同时，教师也要清楚地认识到，翻转课堂在实施过程中存在困难和挑战，要与传统教学方式中的优势相结合，发挥其特有的效果，解决课程在传统授课中多年存在的问题。

1.2.2 MSP法检测RASSF1A甲基化水平

DNA提取及修饰：取50 mg组织，使用蛋白酶K消化法提取组织DNA，采用DNA纯化试剂盒（QIAGEN，德国）提取血浆样本中的基因组DNA，按试剂盒说明书操作。提取后的DNA用紫外分光光度计（岛津UV⁃1750，日本）测定浓度及纯度。DNA甲基化修饰使用The Intergen CpGenome DNA Modification Kit（QIAGEN，德国），取DNA 1 μg用3 mol/LNaOH处理变性后，再通过亚硫酸氢钠修饰，50℃避光水浴过夜，修饰后的DNA用乙醇沉淀回收并用去离子水重悬，即可用于MSP的检测。

MSP检测：针对RASSF1A基因启动子的转录调控区域，根据参考文献［3］合成基因的各PCR引物，甲基化引物对的上游引物序列为5′⁃GTGTTA⁃ACGCGTTGCGTATC⁃3′，下游引物序列为 5′⁃AACCCCGCGAACTAAAAACGA⁃3′；非甲基化引物对的上游引物序列为5′⁃TTTGGTTGGAGTGT⁃GTTAATGTGT ⁃3′，下游引物序列为5′⁃CAAACCCCACAAACTAAAAACAA⁃3′。

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。用χ2检验分别比较不同病理分期患者、鳞癌和非鳞癌患者、发生转移和未发生转移患者组织和血浆中RASSF1A基因甲基化阳性率；t检验分别比较鳞癌和非鳞癌患者、发生转移和未发生转移患者术前血清SCC水平。单因素方差分析法比较不同病理分期患者术前血清SCC水平差异。通过绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteris⁃tic curve，ROC）制定实验数据的截断点，采用Ka⁃plan⁃Meier进行生存分析，生存曲线比较采用Log Rank检验。以上统计学分析以P＜0.05为差异具有统计学意义。

比如，我曾在全县优质课比赛中观摩了五位教师的课，参赛的五位教师同教一篇课文《秋浦歌》，他们都能够积极引导学生投入到对课文的理解与背诵之中，把该学的生字学会了，该品味的字词品味了，该朗读的朗读了，该背的背诵了，这些内容可以通过量化测评，因此属于显效。学生在教师的引导下不知不觉地进入“炉火照天地”的壮观场面，体会到“红星乱紫烟”的危险、“赧郎明月夜”的艰辛、“歌曲动寒川”的豪迈，用不同的表情和动作“高昂地”“响亮地”朗读课文，反映出了他们对古诗的理解程度和自己所要表达的一种情感。

PCR 反应体系如下：10×PCR 缓冲液2.5 μL，10 mol/L dNTP 4 μL，25 mol/L MgCl24 μL，上、下游引物各1 μL，已修饰的DNA模板10 μL，Taq酶0.5 μL，去离子水补充体积至50 μL。扩增条件如下：94℃预变性 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃1 min，共35个循环。同时分别选取经甲基化酶M.SssⅠ（NEB，美国）处理和未经处理的正常人外周血淋巴细胞DNA作为甲基化、非甲基化阳性对照，去离子水作空白对照。取5 μL反应产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（BIORAD，美国）拍照分析。甲基化引物扩增出条带的样品，判定为甲基化阳性；未甲基化引物扩增出条带、甲基化引物扩增不出条带的样品，判定为甲基化阴性；2种引物均扩增出条带的样品，判定为甲基化阳性。

1.3 统计学处理

广东人吃海鲜火锅，格外讲究，火锅配以鱿鱼、海螺肉、鸡肉、牛肉、墨鱼、牛百叶、海参等生料，再加上蔬菜和佐料。吃时先将各种海鲜依次倒入没油的清汤里，煮熟后捞到各人碗中，然后再倒入鸡肉、牛肉等。吃完肉类，再倒入香菇、青菜等清口，鲜而不腻，味美无比。

2 结果

2.1 患者总体病理分期及组织学类型

结合血清SCC水平、组织RASSF1A甲基化阳性率对NSCLC患者的术后转移判定的ROC曲线的坐标点，血清SCC水平≥4.05 ng/mL预测NSCLC患者发生转移的敏感性和特异性分别为42.3%和 96.8%，约登（Youden）指数为 0.391；RASSF1A甲基化阳性预测NSCLC患者发生转移的敏感性和特异性分别为73.1%和83.9%，Youden指数为0.569。以血清SCC、组织RASSF1A甲基化水平越高，发生转移的风险越高进行危险分层。将血清SCC为4.05 ng/mL、组织RASSF1A发生甲基化（赋值为1）作为危险分层界值绘制Kaplan⁃Meier生存曲线，将入选的NSCLC患者分为高危组（血清SCC水平≥4.05 ng/mL和/或组织RASSF1A发生甲基化，共24例）、低危组（血清SCC水平＜4.05 ng/mL和/或组织RASSF1A未发生甲基化，共33例）。Log Rank（Mantel⁃Cox）检验显示，高危组与低危组患者生存时间差别具有统计学意义（P=0.011，P＜0.05），见图2。

表1 患者总体病理分期及组织学类型 Table 1 The overall pathological stage and histological type of the patient

表中的数据，分子为转移病例数，分母为对应分期及组织类型病例数（包含了转移病例数和未转移病例数之和），括号内为各相应组织类型病例数占对应分期总病例数的百分比。

病理分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期总计细支气管肺泡癌0/2（9.5%）0/1（5.3%）1/1（5.9%）1/4（7%）腺癌0/9（42.9%）5/7（36.8%）6/6（35.3%）11/22（38.6%）鳞癌0/8（38.1%）4/8（42.1%）8/8（47.1%）12/24（42.1%）大细胞癌0/1（4.8%）0/2（10.5%）1/1（5.9%）1/4（7%）腺鳞癌0/1（4.8%）0/1（5.3%）1/1（5.9%）1/3（5.3%）总计0/21 9/19 17/17 26/57

2.2 不同分组患者术前血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率比较

这场虚拟的晚餐极大地刺激了高潮的味蕾，他胃口大开，吃得肠满肚圆。高潮把最后的一枚花生米送进嘴里后，打了一个饱嗝，问“诗的妾”：老婆，你那边吃的什么？

根据出院后12个月NSCLC患者随访的转移情况，绘制血清SCC水平、组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率对NSCLC患者术后转移判定的ROC曲线，血清SCC水平、组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率曲线下面积分别为0.681、0.785、0.647，检验P值分别为0.019、0.000、0.058。以上结果表明血清SCC和组织RASSF1A甲基化阳性率面积有统计学意义，血清SCC和组织RASSF1A甲基化阳性率均符合预测NSCLC术后转移的条件，见图1。

2.3 血清SCC水平、组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率评估患者术后转移的价值

近年来对桑椹菌核病的研究集中在病原菌鉴定，田间流行规律调查，农业、化学防治及潜在生防菌株筛选方面［7，11－13］，无菌核形成相关机理的报道。本试验根据已报道与核盘菌菌核形成相关的Smkl氨基酸保守序列设计简并引物，克隆桑椹缩小型菌核病病菌的丝裂原活化蛋白激酶编码基因 （mitogen－activated protein kinases from Scleromitrula shiraiana，Mmk1），初步揭示其菌核形成分子机理，以期为开发高效专一性杀菌剂，切断菌核病的病害循环提供理论依据，为病害防控提供新的思路和线索。

表2 不同分组患者术前血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率比较 Table 2 Comparison of preoperative serum SCC level,positive rate of RASSF1A methylation in postoperative tissue and preoperative plasma among different groups

分组 术前血清SCC平均值（x±s，ng/mL）Ⅰ期(n=21)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=17)F值或χ2值P值鳞癌(n=27)非鳞癌(n=30)t值或χ2值P值未转移(n=31)转移(n=26)t值或χ2值P值2.26±1.19 3.22±1.92 3.94±2.85 3.253 0.046 4.58±2.18 1.73±0.67-6.812 0.000 2.31±1.1 4±2.65-3.04 0.002术后组织RASSF1A甲基化阳性率（%）28.57 31.58 70.59 8.100 0.017 48.15 36.67 0.039 0.843 16.13 73.08 18.812 0.000术前血浆RASSF1A甲基化阳性率（%）19.05 21.05 41.18 2.780 0.249 37.04 16.67 1.208 0.205 12.90 42.31 6.305 0.012

图1 血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率预测NSCLC术后转移的ROC曲线 Figure 1 The ROC curves of serum SCC level，positive rate of RASSF1A methylation in postoperative tissue and preoperative plasma that used to predict NSCLC postoperative metastasis

2.4 生存曲线分析

57例NSCLC患者，总体病理分期及组织学类型分布见表1。其中26例（45.6%）因肺癌转移再次入院，为转移组。其余31例未发生转移为未转移组。

比较不同病理分期患者术前血清SCC、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率，Ⅲ期均高于Ⅱ期、Ⅱ期高于Ⅰ期，3组间术前血清SCC水平、术后组织RASSF1A甲基化阳性率差异均有统计学意义（P＜0.05），术前血浆RASSF1A甲基化阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。鳞癌（包括鳞癌和腺鳞癌）患者术前血清SCC水平高于非鳞癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05），组织、术前血浆RASSF1A甲基化阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。发生转移的患者术前血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率均高于未发生转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），具体数据见表2。

3 讨论

图2 不同危险分层的Kaplan⁃Meier生存曲线 Figure 2 Kaplan⁃Meier survival curves of different risk stratification

由于非小细胞肺癌易复发和转移，因此判断临床病情的严重程度、危险分层和术后转移给患者带来了很大的困难。在非小细胞肺癌的研究中，主要依靠病理分期、生物标志物和患者的临床特征来预测预后。寻找非小细胞肺癌转移标志物是肺癌研究领域的热点之一。近年来，CA125、CYFRA21⁃1、CEA等生物标志物已被确定在非小细胞肺癌的发生和发展中有重要作用。同时，还为非小细胞肺癌的诊断、危险分层、疗效评价和术后转移提供了有力的支持。

在本研究中使用的SCC是一种常用的肿瘤标志物，其在子宫、肺、头部和颈部等鳞癌中均有表达。大量的临床研究表明，检测SCC有助于判断非小细胞肺癌患者的术后转移，尤其是在肺鳞状细胞癌患者中［4⁃6］。在非小细胞肺癌患者中，血清SCC的升高可能提示转移或预后差。本研究结果显示，越后期的病理分期，术前血清SCC水平越高，可以辅助病理分期的诊断；同时，鳞癌患者SCC水平可以作为肺鳞状细胞癌的鉴别诊断指标；高水平SCC转移率较高与国内外SCC对于NSCLC术后转移评价的研究结果一致［4⁃6］。

在NSCLC标志物的研究中，通过检测可预测化疗疗效和预后的分子标记物，可以识别出可从化疗中受益的早期患者。RASSF1A是一个抑癌基因，多项研究表明其启动子区异常的高甲基化会导致其丧失抑癌功能［8⁃9］。另外，有研究指出，肿瘤细胞在坏死的过程中，可释放DNA进入循环血中，与相应的原发肿瘤细胞在分子层面的变异相一致［10⁃11］。但是 NSCLC 的基因甲基化研究仅局限于组织方面，仅有少数检测循环血中的研究［12］。针对河北地区人群的相关性研究表明，血浆中甲基化RASSF1A基因的检出率与NSCLC的分化程度有关［13］。也有研究指出，肺癌组织和血浆RASSF1A基因甲基化检出率与患者分化程度、淋巴结转移有关［14］，非小细胞肺癌患者的淋巴结有更高比例的RASSF1A基因甲基化检出率［15］。这与本研究的结果具有一致性。本实验通过检测NSCLC患者术后组织和血浆RASSF1A甲基化水平，并对患者进行12个月的随访，随访期间发生转移的患者组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率均高于未发生转移的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明RASSF1A甲基化与NSCLC患者术后转移相关，有望作为NSCLC术后转移预测的新型标志物。另外，病理分期越晚，组织RASSF1A甲基化阳性率越高，可作为病理分期的辅助标志物［16⁃17］。

本文研究结果表明，血清SCC和组织RASSF1A甲基化阳性率均可作为NSCLC术后转移的标志物，但分别使用的正确诊断指数（约登指数）并不高。Log Rank（Mantel⁃Cox）检验显示，血清SCC、组织RASSF1A甲基化水平高与水平低的患者生存时间差异具有统计学意义（P＜0.05）。血清 SCC、组织 RASSF1A甲基化水平都与NSCLC的危险分层有关，且水平越高发生转移事件的风险越大。综上所述，血清SCC、血浆和组织RASSF1A甲基化水平在NSCLC患者危险分层及术后转移评估中有一定的临床意义。

本研究数据仅限于龙岩地区，样本量不够大；此外，本研究以无转移的NSCLC患者为对照组，未建立良性肺病对照组、小细胞肺癌对照组，随访持续时间仅为一年。以上是本研究的不足之处。因不同的标志物有各自独特的生物学特性和代谢过程，在NSCLC的发展过程中协同或单独发挥作用，如果能对NSCLC患者血清SCC、血浆RASSF1A甲基化水平联合并持续检测，同时结合影像学等其他诊断手段，将有利于对NSCLC术后转移不良患者的监测和干预，对延缓病情进展、延长患者的生存时间有重要意义。

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