宫颈癌是全球妇女第二大常见恶性肿瘤，在正常宫颈上皮发生宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）至宫颈癌这一进展过程中，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染扮演着重要的角色［1］。高危型HPV持续感染导致宫颈粘膜细胞免疫障碍，是诱导CIN和宫颈癌发生的重要机制［2⁃3］。程序性细胞死亡分子⁃1/程序性细胞死亡分子配体⁃1（programmed death⁃1/programmed death ligand⁃1，PD⁃1/PD⁃L1）抑制途径能够降低抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）和T淋巴细胞对肿瘤的免疫清除，促进肿瘤的发生和发展。然而，HPV感染是否会影响宫颈上皮细胞的PD⁃L1表达及对肿瘤进展的影响仍未阐明。本研究通过对比不同程度CIN和宫颈鳞癌（cervical squamous carcinoma，CSC）患者的 PD⁃1和PD⁃L1表达差异，探讨二者在CIN和宫颈鳞癌进展中的评估意义和临床价值，为宫颈癌的预后判断及治疗寻找新的靶点。

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1 材料与方法

1.1 病例收集及分组

收集来自中国人民解放军总医院第一附属医院的两组患者，第一组病例患者进行了子宫颈活检或锥切，根据病理诊断和高危型HPV检测结果，分为 CIN 0 HPV（-）、CIN 0 HPV（+）、CIN ⅠHPV（+）、CIN Ⅱ-Ⅲ HPV（+）小组，每小组 10例；患者年龄从28至45岁，平均年龄为35.7岁，各小组间年龄无显著差异（P＞0.05）。第二组病例患者行宫颈鳞癌根治手术，分为原发浸润性CSC患者不伴盆腔淋巴结转移的CSC转移（-）组和伴有盆腔淋巴结转移的CSC转移（+）组，每组10例，其中转移组根据肿瘤部位不同分为原发灶、淋巴管癌栓和淋巴结转移灶，患者年龄从39至63岁，平均年龄为51岁，各组间年龄无显著差异（P＞0.05）。以上患者的排除标准包括：性传播疾病、生殖道感染性疾病、免疫缺陷病、妊娠、经免疫抑制剂治疗等。

1.2 病理学检查及高危型HPV亚型检测

宫颈组织标本用4%中性甲醛固定24～48 h，经脱水、石蜡包埋、切片及常规苏木素⁃伊红（hema⁃toxylin⁃eosin，HE）染色，光镜观察。由 2名高年资病理医师对病变进行形态学观察并作出病理诊断。宫颈标本经蛋白酶K处理，提取组织DNA。采用导流杂交基因芯片技术和荧光定量PCR方法进行 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66亚型检测。β⁃Globin和蒸馏水分别作为内参和阴性对照。

1.3 免疫组织化学标记及评分

石蜡包埋组织标本经常规脱蜡及梯度酒精脱水处理。利用罗氏Ventana自动免疫组化仪进行抗原修复、抗体标记及DAB染色。标记的一抗包括：小鼠抗人PD⁃1（北京中杉金桥生物技术有限公司）、小鼠抗人p16INK4a（北京中杉金桥生物技术有限公司）和小鼠抗人PD⁃L1（Abcam，美国）。二抗检测试剂盒购自罗氏诊断试剂公司。以蒸馏水代替一抗作为阴性对照。利用Allred评分系统对免疫组化标记结果进行判读，具体标准如下：比例评分：0 分⁃无，1 分⁃＜1/100，2 分⁃1/100～1/10，3 分⁃1/10～1/3，4 分⁃1/3～2/3，5 分⁃＞2/3；强度评分：1 分⁃弱，2 分⁃中等，3 分⁃强［4］。每张切片观察 10个高倍视野，计算比例和强度分值之和（0～8分）的平均值。

1.4 统计学处理

本研究数据结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 15.0软件对各比较组进行非参数Krus⁃kal⁃Wallis检验统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

PD⁃L1是新近发现的一种负性共刺激分子，广泛表达于APC、活化的T、B细胞、巨噬细胞和胸腺皮质上皮细胞等［5］。PD⁃L1的受体为CD28家族成员 PD⁃1，主要表达于 T 淋巴细胞［6］。PD⁃1与PD⁃L1特异性结合诱导T淋巴细胞无能性分化或凋亡，抑制肿瘤免疫反应，促使病毒感染细胞或肿瘤细胞逃逸机体免疫清除［7⁃8］。我们的前期临床研究结果表明，高危型HPV阳性CIN患者宫颈T淋巴细胞的PD⁃1和树突细胞的PD⁃L1表达随着CIN级别的升高而明显上调［9］。相关研究也表明，肿瘤细胞及肿瘤微环境能够通过上调PD⁃L1表达与肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞PD⁃1蛋白的IgV样结构域结合，磷酸化PD⁃1胞浆区的免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine⁃based inhibitory motif，ITIM）使下游的效应分子去磷酸化，如磷脂酞肌醇激酶 3（phosphoinositide 3⁃ki⁃nase，PI3K），从而抑制 T 细胞凋亡抑制基因 Bcl⁃xl的转录，促进T细胞凋亡，发挥负向免疫调节作用，降低机体免疫应答［10］。本研究进一步发现PD⁃L1除表达在APC外，高危型HPV感染可以使宫颈鳞状上皮的PD⁃L1表达和TAMs、TILs的PD⁃1表达亦明显升高，同时二者表达与CIN的级别呈正相关，表明PD⁃1/PD⁃L1参与了宫颈细胞免疫的负性调节，并与HPV感染和CIN进展密切相关。

2 结果

2.1 高危型HPV亚型检测结果

PD⁃L1标记阳性细胞为胞膜有棕黄色物质沉积。第一组病例中，PD⁃L1主要表达于CIN病变的上皮细胞（图1A～1D），CIN 0 HPV（+）组显著高于CIN 0 HPV（-）组（P<0.05）；同时在HPV（+）组之间，PD⁃L1的表达随着CIN的级别上升而显著升高，即 CIN I组显著高于 CIN 0组（P<0.01），CINⅡ-Ⅲ组显著高于CIN I组（P＜0.01）（图1I）。第二组病例中，PD⁃L1主要表达于鳞癌细胞（图1E～1H），CSC转移（+）组原发灶显著高于CSC转移（-）组原发灶（P<0.05），而且CSC转移（+）组的淋巴管癌栓和淋巴结转移灶较其原发灶表达显著升高（P＜0.05和P＜0.01）（图1J）。

2.2 PD⁃L1免疫组化标记结果

第一组检测的30名HPV阳性患者中，HPV16和HPV18是感染率最高的亚型，感染率均为33.3%（10/30），其次为 HPV58和 33亚型，感染率分别为16.7%（5/30）和13.3%（4/30），单一亚型感染率为73.3%（22/30），多重亚型感染率为26.7%（8/30）。第二组20名患者HPV检测均为阳性，HPV16感染率最高，感染率为45%（9/20），随后为 HPV18，感染率为 20%（4/20），HPV51、52和58亚型，感染率均为10%（2/20），单一亚型感染率为75%（15/20），多重亚型感染率为25%（5/20）。

图1 PD⁃L1蛋白表达及变化 Figure 1 Changes of PD⁃L1 protein expression

A：CIN 0 HPV（-）组（免疫组化，×400）；B：CIN 0 HPV（+）组（免疫组化，×400）；C：CIN I HPV（+）组（免疫组化，×400）；D：CIN Ⅱ-ⅢHPV（+）组（免疫组化，×400）；E：CSC转移（-）组（免疫组化，×400）；F：CSC转移（+）组原发灶（免疫组化，×400）；G：CSC转移（+）组淋巴管癌栓（CSC embolus）（免疫组化，×400）；H：CSC转移（+）组淋巴结转移灶（metastatic CSC）（免疫组化，×400）；I：CIN组PD⁃L1蛋白All⁃red评分统计分析柱状图；J：CSC组PD⁃L1蛋白Allred评分统计分析柱状图；*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 PD⁃1免疫组化标记结果

p16INK4a标记阳性细胞的胞核及胞浆有棕黄色物质沉积。在第一组病例中，p16INK4a主要表达在CIN病变的上皮细胞（图 3A～3D），CIN 0 HPV（-）组和CIN 0 HPV（+）组均低表达p16INK4a，二者之间无统计学差异（P＞0.05），但CIN I HPV（+）组p16INK4a的表达显著高于CIN 0 HPV（+）组（P＜0.01），并且CIN II～III组显著高于CIN I组（P＜0.01）（图 3I）。在第二组病例中，p16INK4a在鳞癌细胞中弥漫性高表达（图3E～3H），CSC转移（+）组原发灶的p16INK4a表达显著高于CSC转移（-）组原发灶（P＜0.05），在CSC 转移（+）组淋巴管癌栓及淋巴结转移灶的p16INK4a表达均显著高于其原发灶（P＜0.05）（图3J）。

2013年春，我们在河南省许昌市建安区尚小杨家庭农场以韩国蜜梨、南水梨为主栽品种，建立矮化密植梨园14 hm2，采取拱棚架结构整形修剪技术和精细化管理措施，实现了梨树生产“早、优、稳、低”，即“梨树成形结果早、果实品质优、易稳产、劳动强度低”的高效经济栽培目标。定植第2年开始挂果，第3年进入初果期，亩产量500 kg，第4年达到2 000 kg，目前梨树盛果期优质果亩产量稳定在3 500 kg。现将梨树拱棚架矮化密植栽培技术总结如下。

图2 PD⁃1蛋白表达及变化 Figure 2 Changes of PD⁃1 protein expression

A：CIN 0 HPV（-）组（免疫组化，×400）；B：CIN 0 HPV（+）组（免疫组化，×400）；C：CIN I HPV（+）组（免疫组化，×400）；D：CIN Ⅱ-ⅢHPV（+）组（免疫组化，×400）；E：CSC转移（-）组（免疫组化，×400）；F：CSC转移（+）组原发灶（免疫组化，×400）；G：CSC转移（+）组淋巴管癌栓（CSC embolus）（免疫组化，×400）；H：CSC转移（+）组淋巴结转移灶（metastatic CSC）（免疫组化，×400）；I：CIN组PD⁃1蛋白Allred评分统计分析柱状图；J：CSC组PD⁃1蛋白Allred评分统计分析柱状图；*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 p16INK4a免疫组化标记结果

PD⁃1标记阳性细胞主要为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）和肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs），阳性细胞的胞膜和胞浆有棕黄色物质沉积。第一组病例中，PD⁃1阳性细胞主要分布在CIN病变的鳞状上皮下的间质纤维中（图2A～2D），CIN 0 HPV（+）组的PD⁃1表达显著高于CIN 0 HPV（-）组（P＜0.05）；同时在 HPV（+）组之间，PD⁃1的表达随着CIN的级别升高而增加，即CIN I组显著高于CIN 0组（P ＜0.05），CINⅡ⁃Ⅲ组显著高于CIN I组（P＜0.01）（图 2I）。第二组病例中，PD⁃1阳性细胞分布在鳞癌细胞之间（图2E～2H），CSC 转移（+）组原发灶的PD⁃1表达显著高于CSC转移（-）组原发灶（P<0.01），在CSC转移（+）组淋巴结转移灶的PD⁃1表达显著高于其原发灶（P<0.01），但淋巴管癌栓的PD⁃1表达与其原发灶相比差异无统计学意义（P>0.05）（图2J）。

图3 p16INK4a蛋白表达及变化 Figure 3 Changes of p16INK4a protein expression

A：CIN 0 HPV（-）组（免疫组化，×400）；B：CIN 0 HPV（+）组（免疫组化，×400）；C：CIN I HPV（+）组（免疫组化，×400）；D：CIN Ⅱ-ⅢHPV（+）组（免疫组化，×400）；E：CSC转移（-）组（免疫组化，×400）；F：CSC转移（+）组原发灶（免疫组化，×400）；G：CSC转移（+）组淋巴管癌栓（CSC embolus）（免疫组化，×400）；H：CSC转移（+）组淋巴结转移灶（metastatic CSC）（免疫组化，×400）；I：CIN组p16INK4a蛋白Allred评分统计分析柱状图；J：CSC组p16INK4a蛋白Allred评分统计分析柱状图。*P＜0.05，**P＜0.01。

3 讨论

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肿瘤浸润淋巴细胞是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，其数量及功能间接反映了机体抗肿瘤免疫应答的强弱［11］。恶性肿瘤细胞异常表达PD⁃L1，通过激活 PD⁃L1/PD⁃1途径抑制 T细胞增殖和细胞因子分泌，逃避机体免疫应答，促进肿瘤进展和转移。相关研究证实，肾癌细胞PD⁃L1表达水平及PD⁃1阳性肿瘤浸润淋巴细胞数量均与患者预后呈负相关［12］。针对卵巢肿瘤的研究也发现，依据PD⁃L1表达水平以及肿瘤浸润CD8+T细胞数量可以预测卵巢癌患者的预后［13］。本研究结果表明，宫颈癌原发灶PD⁃L1和PD⁃1的表达在发生转移患者中显著高于未发生转移患者，并且发生转移患者的淋巴管癌栓和淋巴结转移灶较其原发灶表达亦显著升高，提示PD⁃L1和PD⁃1表达水平与宫颈癌的预后密切相关，二者高表达预示PD⁃L1/PD⁃1途径激活，负性调控机体的抗肿瘤免疫应答功能，进而促进肿瘤逃逸机体免疫清除，容易发生局部进展和远处转移。

p16INK4a是细胞周期调节蛋白⁃依赖酶抑制剂，也是肿瘤抑癌基因的产物，其编码的蛋白能特异性抑制CDK4活性，阻止细胞由G1期进入S期，导致细胞周期停滞于G1期，干扰或抑制细胞的过度增殖。相关研究证实，p16INK4a蛋白表达上调是结直肠癌的重要免疫表型特征，且无淋巴结或远处转移者表达高于有淋巴结或远处转移者，可作为结直肠癌诊断及转移能力评估的重要分子靶标［14］。研究证实，p16INK4a在CIN及宫颈癌的表达显著升高，临床上p16INK4a是判断CIN和宫颈癌预后的指标，本研究结果表明CIN级别升高及宫颈癌发生转移时，p16INK4a表达显著上升，这与以往报道的结果相符［15］。新近研究发现，虽然HPV感染的上皮细胞能被宫颈免疫系统识别，但仍然能够逃逸机体的免疫清除，这与HPV感染导致的宫颈局部细胞免疫障碍密切相关［16］。在多种慢性病毒感染性疾病中，PD⁃1/PD⁃L1信号途径被激活并发挥负性免疫调节作用，能够抑制细胞毒性T淋巴细胞增殖、活化及建立有效的免疫应答反应，从而导致细胞免疫对病毒感染细胞的免疫耐受或无应答［17］。本研究进一步发现，p16INK4a表达变化与宫颈PD⁃L1和PD⁃1的表达变化存在相关性和一致性，即随着CIN级别升高及肿瘤转移而表达上调，提示p16INK4a基因在宫颈高危型HPV感染相关CIN及宫颈癌中参与了抗肿瘤过程中的负性免疫应答反应，其高水平表达提示机体免疫清除能力下降，与CIN及宫颈癌的免疫逃逸及肿瘤进展密切相关。

汤泉池温泉、国家森林公园黄柏山、国家地质公园金刚台、道教圣地观音山和西河风景区已成为商城的名片，应继续做好深层次的开发，保持传统优势。同时，实施商城旅游的精品发展战略，突出传统旅游项目的特色，扩大吸引力和市场占有率。

总之，本研究结果表明PD⁃L1和PD⁃1表达升高与宫颈HPV阳性、CIN级别升高和肿瘤转移呈正相关。PD⁃1/PD⁃L1途径的活化同时伴随着p16INK4a表达上调，提示机体抗肿瘤免疫能力下降和肿瘤进展。因此，PD⁃L1和PD⁃1表达水平可以作为CIN和宫颈癌临床预后指标，阻断PD⁃L1/PD⁃1通路的治疗有望成为宫颈癌免疫治疗的有效靶点。

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