软骨细胞生长于高度水化的细胞外基质(ECM)中，通过分化簇抗原44(CD 44)和整合素等细胞表面受体与ECM不断相互作用。在软骨修复工程中，使用类似于ECM的仿生支架对促进软骨细胞增殖和分化非常重要。

可注射水凝胶具有以下优点：①具微创性，可通过关节镜技术将液态水凝胶注射到软骨缺损部位；②液态的水凝胶完全填充不规则缺损后，通过交联可变为固态，增强力学性能。透明质酸(HA)是软骨ECM中糖胺聚糖(GAG)的重要成分，可用于制作可注射水凝胶。但是，HA可注射水凝胶在交联时可引入一些潜在的细胞毒性分子，如光敏剂和催化剂，引起细胞损害。因此，开发无潜在细胞毒性的HA可注射水凝胶，仍然是软骨缺损修复中亟待解决的问题。

就不同年级的纵向比较来看，由于学习基础和学习风气不同，在教学目标达成程度上也表现出一定的差异性。就不合格率而言，大三的学生较差于其他两届，对学习内容得掌握不合格的学生比例较高，比例为42.1%。其他两届学生不合格率均低于大三学生，分别为大二的36.8%和大四的21.1%。

以腙为主，主要利用酰肼和醛官能团的交联方法近年来受到极大关注。该交联方法不使用任何有潜在毒性的试剂，效率高，无副产物，反应条件温和，细胞相容性良好[1]。但是，由于缺乏必要的功能基团，纯HA水凝胶无法完全模仿软骨ECM微环境。果胶是植物细胞壁中提取的天然多糖，廉价且无免疫原性，适合进行功能化[2]，RGD寡肽则是ECM蛋白中细胞膜整合素识别的最小序列[3]。引入果胶和RGD寡肽可提高HA水凝胶的性能，更有利于软骨再生。

我们发现了一种具有良好性质的仿生可注射HA /果胶水凝胶支架。这种支架由HA-己二酸二酰肼(HA-ADH)与RGD寡肽功能化果胶二醛(PAD)发生凝胶化反应形成。终产物HA-ADH/PAD-RGD水凝胶成胶速度快，具有可调节的力学性能、可控的降解行为、优异的细胞相容性和组织耐受性。总的来说，枝接一定比例的RGD寡肽到HA/果胶类水凝胶能够提供一种模拟机体组织的微环境，有利于维持软骨细胞表型，促进间充质干细胞的成软骨分化，为软骨再生提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

收集分化后的水凝胶，用PBS洗涤，并用木瓜蛋白酶消化溶液消化(57℃，反应16 h)。以硫酸软骨素为标准，使用1，9-二甲基亚甲基蓝(DMB)染料分光光度法在530 nm处测量吸光度,计算每个样品(每组n=6)的总GAG含量，并通过试剂盒定量测定每个样品裂解物中的DNA量，对GAG含量进行标准化，标准化GAG含量=GAG含量/DNA含量。

记忆中，在我4岁那年，由中国国际电视总公司出品了一部41集古装神话剧——改编自明代小说家吴承恩同名文学古典名著《西游记》。1986年春节一经播出便轰动全国，可谓老少皆宜，获得了极高评价。至今仍是寒暑假期间被重播最多的电视剧之一，百看不厌，成为一部公认的、无法超越的经典。该剧讲述的是孙悟空、猪八戒、沙僧辅保大唐高僧玄奘(唐僧)去西天取经的故事，师徒四人一路抢滩涉险，降妖伏怪，历经九九八十一难，取回真经，终修成正果的故事。

实验动物：新西兰兔2只，雄性，3月龄，体质量2～2.5 kg。

1.2 水凝胶的制备和检测

1.2.1 HA-ADH的制备和修饰

将第3次传代后的细胞悬液以细胞浓度105个/cm2接种于预先置入盖玻片的6孔培养板中，各孔加入2 mL高糖DMEM成软骨诱导培养液(含50 mg/L维生素C、0.272 g/L L-谷氨酰胺、6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L亚硒酸、1.25 g/L牛血清白蛋白、1 mmol/L 丙酮酸盐、5.35 mg/L亚油酸、10 mg/L转化生长因子-β1 、10-7 mol/L地塞米松)，诱导至少3周，诱导成功的细胞可称为软骨细胞。

1.2.2 果胶的生物功能化

PAD按照文献报道方法进行修饰[5]。室温下，黑暗环境中加入一定量的NaIO4后，将果胶溶液混合。12 h后加入乙二醇停止反应，以减少过量的NaIO4。将溶液透析后冷冻干燥得到产物。取6份样品，通过羟胺盐酸盐法测定PAD的氧化度[5]。随后，通过碳二亚胺化学反应，用G4RGDS共价修饰PAD[2]。将PAD溶于MES缓冲液(0.1 mol/L，0.3 mol/L NaCl)中。然后，以每克PAD中加入17.4 mg NHS、58.0 mg EDAC和30.0 mg寡肽制备混合液，pH始终保持约6.5，并使混合溶液在恒定搅拌下反应48 h。将溶液透析并冻干，所得产物为PAD-RGD。另外，取3份样品，通过氨基酸分析仪评价与PAD结合的G4RGDS的量。通过GPC法测定PAD和PAD-RGD的Mw。

1.2.3 HA-ADH/PAD-RGD水凝胶形成

在37℃，将HA-ADH和PAD-RGD溶于去离子水中形成3%(w/v)溶液，然后将HA-ADH溶液与PAD-RGD溶液以不同质量比(8∶2、6∶4、4∶6)混合，涡旋形成透明凝胶，分别为8∶2、6∶4、4∶6质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶。

1.2.4 水凝胶的形态学研究

将3种质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶冷冻干燥处理，放入液氮中1～2 min。然后快速用薄刀片纵向切水凝胶样品形成横断面，粘到导电胶上，喷金，装样。在扫描电子显微镜下观察各质量比水凝胶横断面孔径大小及分布。

在上述量化因子和比例因子的基础上，根据竖井掘进机的施工特点，采用高斯分布型隶属函数，可实现输入输出变量的模糊化处理。

1.2.5 凝胶时间和平衡溶胀比

从HA-ADH与PAD-RGD溶液混合时开始计时，采用小瓶倒置1 min内不流动作为凝胶终点，记录时间。另外，精确秤取冷冻干燥的HA-ADH/PAD-RGD水凝胶的质量(W0)，37℃下浸入PBS液(pH 7.4，0.01 mol/L)中48 h，直至达到溶胀平衡。取出溶胀的水凝胶，用滤纸吸去表面多余水分后立即秤取质量(We)。平衡溶胀比(ESR)=(W0-We)/W0。

1.2.6 压缩模量

HA-ADH/PAD-RGD水凝胶制备后放置6 h，取3种质量比水凝胶样品(直径2 cm，高2 cm)用质构仪测试压缩模量。测试参数为压力0.49 N/m2，下压速率0.5 mm/s。以压强为纵坐标，应变为横坐标，画出曲线图。由于样品上下表面不平，则取应变5%～30%范围，曲线斜率为压缩模量值，进行4次平行实验，取均值。

1.2.7 体外降解

将3种质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶冻干并准确记录初始质量(W1)，37℃下于振荡水浴(约50 r/min)中与特定降解溶液温育。3种质量比水凝胶各分为两组，每组6个样本。对照组在PBS液(pH=7.4，0.01 mol/L)中温育，实验组在含有HAse(100 U/mL凝胶)的酶缓冲液中温育。间隔一定时间，除去水凝胶，冻干并称取质量(W2)，然后向每个样本中加入新鲜培养基，计算剩余质量比(%)=W2/W1×100%。

既确保集团公司一体化运行不受大的冲击，又能很好实现市场化运作，使集团公司真正以市场为导向，以效益最大化为目标组织生产经营。

1.3 细胞培养与鉴定

1.3.1 细胞培养

全麻后于新西兰兔双侧髂后上棘处骨髓穿刺，取骨髓液4 mL。以全血培养法培养纯化原代自体骨髓间质干细胞(BMSC)。待细胞长至铺满90%瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例传代培养。以后各代均以此密度传代扩增，使用第3代细胞进行实验。

从表2得知，学生的学习计划方面已经有了明显提高。但是，学生中的大部分没有及时监控学习过程、调节学习方法，在英语学习中不能熟练使用监控策略和调节策略。

众多教育名家近乎一致地提倡“农业为主”的生产教育，使得“目前的生产教育完全被笼罩于‘农业为主工业为辅’的氛围气中”[14]。这种情形引起了吴景超、钱亦石等学者的强烈不满。他们在《独立评论》、《东方杂志》等刊物上撰文，以中国社会经济现实与世界经济发展趋势为依据，反驳生产教育“农业为主”论的观点，提出“工业为主”的主张。

1.3.2 细胞诱导

HA-ADH按照文献报道方法进行修饰[4]。室温下，HA和ADH以1∶30(摩尔比)溶于MES缓冲溶液(0.1 mol/L，pH=6.5)中，同时加入EDAC和HOBt，使EDAC∶HOBt∶HA=1.5∶1∶1(摩尔比)，溶液体系pH=6.8。48h后将反应溶液彻底透析后冻干。以1H NMR仪测定HA-ADH的取代度(DS)，凝胶渗透色谱(GPC)法测定其重均分子质量(Mw)。

地质测量在煤矿安全生产过程中作用重大，因此，加强煤矿地质测量必不可少。加强煤矿地质测量的两个有效方法如下：

1.3.3 细胞包裹

软骨细胞包裹前，所有材料均通过钴-60照射灭菌。取不同质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶(8∶2、6∶4、4∶6)的聚合物溶液，然后每组将软骨细胞包裹，并分别编号为A、B、C，置于特异性完全培养基中培养。随后，将软骨细胞以细胞密度6.0×106个/mL混合进水凝胶中。凝胶化后，将其置于37℃含CO2培养箱中，每3 d换液1次，培养21 d。

1.3.4 细胞活性与增殖测定

HA-ADH/PAD-RGD水凝胶质量比8∶2、6∶4、4∶6组的凝胶时间逐渐增加，平均凝胶时间分别为(132.8±4.8) s、(188.7±10.1) s和(328.9±12.6) s，8∶2组与6∶4组比较有统计学差异(P<0.000 1)，6∶4组与4∶6组比较有统计学差异(P<0.000 1)，8∶2组与4∶6组比较有统计学差异(P<0.000 1)，凝胶时间在合理的时间范围内(图2a)。HA-ADH/PAD-RGD水凝胶8∶2、6∶4、4∶6组的ESR值逐渐增加，分别为32.8±1.5、34.8±2.3和36.4±1.9，其中8∶2组与4∶6组比较有统计学差异(P<0.01)，其余组间比较无差异(P>0.05)(图2b)。HA-ADH/PAD-RGD水凝胶8∶2、6∶4、4∶6组的压缩模量分别为(5.6±0.7) kPa、(4.8±0.4) kPa和(3.4±0.4) kPa，其中8∶2组与6∶4组比较有统计学差异(P<0.05)，6∶4与4∶6组比较有统计学差异(P<0.01)，8∶2与4∶6组比较有统计学差异(P<0.000 1)，随着质量比减小其力学强度减小(图2c)。经历49d降解后，HA-ADH/PAD-RGD水凝胶8∶2、6∶4、4∶6组的剩余质量比分别为85.3%、73.5%和55.9%(图2d)。

1.3.5 GAG测定

主要试剂：透明质酸钠(上海阿拉丁公司)，柑橘果胶(Fluck公司，美国)。高碘酸钠(NaIO4)、ADH、4-吗啉代乙磺酸(MES)、氯胺-T、对二甲基氨基苯甲醛、软骨素酶ABC、蛋白酶K(≥30单位每mg蛋白质)、透明质酸酶(HAse)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均购自美国Sigma-Aldrich公司。RGD寡肽序列(G4RGDS)(上海GL肽公司)。1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)(上海梯希爱公司)。N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)(Adamas公司，美国)。所有其他试剂均购自国药化学试剂公司，PicoGreen dsDNA试剂盒(Life Technologies公司，中国)。

主要仪器：氨基酸分析仪(L-8900, Hitachi, 日本)，扫描电子显微镜(SEM)(S-4800, Hitachi, 日本)，1 H NMR仪(400 MHz,美国)，实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)仪(Roche公司,美国)，酶标仪(BioTek公司，美国)。

1.3.6 免疫荧光染色

将软骨细胞包裹于水凝胶中培养21 d，取出后用PBS清洗，放置于包埋盒中。10%多聚甲醛液4℃固定，过夜。然后酒精脱水，制作石蜡组织切片(厚度10 μm)，并储存于室温，用于后期的免疫荧光染色。

Ⅱ型胶原为软骨细胞的特异性蛋白，我们对该蛋白进行免疫荧光染色。主要步骤：①对已制成的组织切片脱蜡，酒精脱水，于3%过氧化氢(H2O2)中孵育20 min，反复洗涤，以减弱外源性HRP带来的非特异性染色；②进行抗原修复，30 min，反复洗涤；③分别滴加鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆一抗和兔抗人蛋白聚糖多克隆一抗，放入4℃冰箱孵育过夜，反复洗涤；④滴加山羊抗鼠二抗，室温避光孵育2h，反复洗涤，并用DAPI在避光条件下染细胞核10 min，反复洗涤，滴加防荧光淬灭剂，封片，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.3.7 RT-PCR法测定相关基因表达

包裹软骨细胞的水凝胶在培养21 d后收集样品，根据Thermo试剂盒说明书，用Trizol提取RNA，所提取的总RNA进行逆转录为cRNA，然后进行RT-PCR反应。以β -actin为内参基因，Ⅰ 型胶原(CoL Ⅰ)和Ⅱ 型胶原(CoL Ⅱ)为目标基因。反应程序设定如下：95℃ 预变性10 min；循环数45，95℃ 变性5 min，60℃下退火延伸60 s；末段延伸60℃ 5 min；溶解曲线75℃ 至95℃ 中，每20 s升温1℃，每轮循环结束后采集荧光信号，待全部循环完成后，对溶解曲线进行分析以确保产物的特异性。数据处理采用ΔΔCT算法。所使用引物序列见表1。

2.2 两组患者生活质量比较 两组患者的社会功能、躯体功能、角色功能及认知功能较治疗前均有所改善，差异有统计学意义(P<0.05)。B组的改善程度较A组更为显著，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

 

表1 引物序列信息

  

基因引物序列(5'-3')长度CoLⅡ正向序列TGGGCAGAGGTATAATGATAAGGA反向序列CTTCACAGATTATGTCGTCGCAG101CoLⅠ正向序列GAAGACATCCCACCAGTCACCT反向序列CGCTGGGACAGTTCTTGATTTC154β- actin正向序列CATCGTCCACCGCAAATGCTTCT反向序列CGACTGCTGTCACCTTCACCGTTC217

1.4 统计学分析

以SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，采用两样本t检验。以P<0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.2 材料的表征

软骨细胞在HA-ADH/PAD-RGD水凝胶中培养21 d后，呈均匀分布，均保持高达95%的存活率，表明HA-ADH/PAD-RGD水凝胶具有良好的细胞相容性，适合软骨细胞长时间培养。此外，所有凝胶内部都具有较高的细胞密度，表明细胞在凝胶内部能够增殖(图3)。以上发现可通过测定每mg干凝胶中dsDNA含量进一步获得证实。培养1 d后，HA-ADH/PAD-RGD水凝胶8∶2、6∶4、4∶6组的dsDNA含量分别为(0.7±0.1)μg、(0.6±0.1) μg和(0.6±0.1) μg，3组间无统计学差异(P>0.05)。培养21 d后，6∶4组dsDNA含量为(1.9±0.2) μg高于8∶2组[(1.6±0.1) μg， P<0.000 1]和4∶6组[(1.5±0.1) μg， P<0.000 1](图4)。以上结果进一步证明了这种凝胶系统适合长时间培养软骨细胞，凝胶组成可显著促进软骨细胞的增殖。

  

图1 HA-ADH/PAD-RGD水凝胶横断面扫描电镜图像

取1 mL试剂C加9 mL无菌去离子水稀释为1 mL/L染色缓冲液。每10 mL稀释染色缓冲液C(1 mL/L)加入10μL染色液A和3～10 μL染色液B，充分混匀，即成染色工作液D。收集样本细胞，细胞数量在1×106个以内。用PBS洗涤细胞2次。用200 μL染色工作液D将细胞重悬。在-4℃避光孵育15～30 min，PBS洗涤细胞，适量PBS重悬细胞，用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。荧光显微镜下，使用(490±10) nm波长激发，存活细胞为黄绿色，凋亡细胞为红色。用Image J软件进行存活细胞计数。

  

图2 不同质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶特性测定 a. 凝胶时间 b. 平衡溶胀比 c. 力学强度 d.体外降解

3.2 细胞活性和增殖试验

扫描电子显微镜下观察可见，HA-ADH/PAD-RGD水凝胶横断面呈非均一的连续多孔结构，主要为凝胶内部水分子升华致孔(图1)。8∶2和4∶6组水凝胶的孔径尺寸为200～300 μm，6∶4组为100～200 μm。孔径尺寸70～120 μm适合软骨细胞生长和发挥正常生理功能。

 

3.3 成软骨分化

RT-PCR法检测CoLⅡ(软骨形成标志基因)和CoLⅠ(软骨去分化标志基因)表达的结果显示，培养21 d后，8∶2组、6∶4组和4∶6组水凝胶CoLⅡ基因表达分别为(1.3±0.2)、(2.3±0.2)和(1±0.1)，6∶4组高于8∶2组(P<0.000 1)和4∶6组(P<0.000 1)，8∶2组高于4∶6组(P<0.000 1)；8∶2组、6∶4组和4∶6组水凝胶CoLⅠ基因表达分别为(1.5±0.1)、(1.0±0.1)和(1.7±0.3)，6∶4组低于8∶2组(P<0.000 1)和4∶6组(P<0.000 1)，8∶2与4∶6组比较无统计学差异( P>0.05)，见图5。

  

图5 RT-PCR法测定的相关基因表达 a. CoLⅠ b. CoLⅡ

培养21 d后，8∶2组、6∶4组和4∶6组水凝胶中GAG 产生量分别为(9.1±1.4) μg、(16.5±1.4) μg和(8.8±1.0) μg，6∶4组明显高于8∶2组(P<0.000 1)和4∶6组(P<0.000 1)，8∶2组与4∶6组间无差异(P>0.05)(图6a)。标准化后GAG含量依次为(6.0±0.6) μg、(10.0±1.2) μg、(6.0±0.5)μg，6∶4组明显高于8∶2组(P<0.000 1)和4∶6组(P<0.000 1)，而8∶2组与4∶6 组间无差异(P>0.05)(图6b)。以上结果表明，HA-ADH/PAD-RGD水凝胶为软骨细胞提供的微环境能够促进细胞的成软骨分化，保持软骨细胞的表型。

  

图6 不同质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶GAG产生量 a. GAG产生量 b. 标准化GAG含量

在免疫荧光染色中，细胞核用DIPA染色定位呈现蓝色荧光，CoLⅡ发绿色荧光。培养21 d后，HA-ADH/PAD-RGD水凝胶8∶2和4∶6组中许多软骨细胞未被CoLⅡ免疫着色，且着色只在细胞周围，细胞之间区域免疫着色很少，呈现出有限的软骨形成蛋白免疫着色。然而6∶4组水凝胶中软骨细胞展现了较强的CoLⅡ免疫着色(图7)。这些结果显示，包裹在HA-ADH/PAD-RGD水凝胶中的软骨细胞有能力维持原有表型和分泌软骨细胞特异性蛋白。进一步对免疫荧光图片进行半定量分析，8∶2组、6∶4组和4∶6组CoLⅡ免疫着色的细胞百分比分别为(53.3±9.2)%、(83.7±15.7)%和(43.9±7.8)%，6∶4组明显高于8∶2组(P<0.000 1)和4∶6组(P<0.000 1)，8∶2组与4∶6组比较无统计学差异(P>0.05)(图8)。

  

图7 HA-ADH/PAD-RGD水凝胶中软骨细胞CoLⅡ免疫荧光染色(40倍)

  

图8 不同质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶中软骨细胞CoLⅡ着色情况

3 讨论

在软骨组织工程中，我们设想设计能够模拟软骨微环境的软骨ECM，使其可促使生物特异性细胞黏附，调控细胞功能，促进新生组织形成，并将其制作为可注射水凝胶。我们利用天然多糖骨架的特性模拟软骨ECM的功能，研制了可注射水凝胶系统。步骤如下：第一，将HA和果胶分别进行化学修饰以枝接酰肼和醛官能团。第二，通过碳二亚胺化学合成G4RGDS进一步修饰PAD，以促进整合素介导的细胞黏附。PAD-RGD不仅可以在生理条件下加速果胶的生物降解，并可在原位形成水凝胶，进而共价结合软骨组织胶原纤维上的氨基，更好地促进软骨细胞与周围天然组织的结合[4]。不同于传统的交联方式，腙交联化学法不需要外来的催化剂或引发剂，可在生理条件下几秒内完成交联反应，不存在潜在毒性[6]。且水作为反应的唯一副产物，也不会带来副作用。

本研究中对不同质量比的HA-ADH/PAD-RGD水凝胶的研究发现，随着PAD-RGD含量增加，水凝胶的凝胶化时间显著增加。快速凝胶化可防止前体扩散，对软骨缺损的填充是必需的，且较低浓度的水凝胶前体易于处理并能均匀地混合细胞和/或生物活性分子。

HA通过与受体结合介导细胞的行为。CD 44为软骨形成过程中的主要HA受体，软骨细胞中高度表达可控制软骨细胞代谢、ECM重塑和软骨再生的CD 44表面抗原[7]。本实验中对不同质量比的HA-ADH/PAD-RGD水凝胶的研究发现， 6∶4组水凝胶对软骨细胞增殖、软骨形成标记基因的表达和软骨ECM标志物的合成更有利。原因可能为，该水凝胶具有适当的组成和交联密度，可形成更为优异的包裹软骨细胞的微环境。

从以上分析中可以看出，这一时期的英语语法研究有很大程度的发展，但不可避免，这一时期的研究还有一定的缺陷及不足。

含有RGD序列的寡肽是研究最广泛的细胞黏附成分之一。软骨细胞通过细胞表面受体和/或整合素与其周围的ECM相互作用。许多ECM蛋白都存在RGD短肽，如软骨低聚基质蛋白和纤连蛋白[8]，这些蛋白通过RGD和整联蛋白受体结合于软骨细胞。整合素结合能够激活细胞内信号转导通路并介导细胞的锚定、迁移、分化和ECM重塑[9]。另外，RGD肽序列共价结合的水凝胶可以产生丰富的GAG以及胶原蛋白[10-12]。因此，将RGD加入到ECM修饰的水凝胶中可以促进ECM微环境中生物特异性细胞的黏附。

此外，本研究中细胞增殖、q-PCR分析、CoLⅡ和聚集蛋白聚糖的免疫荧光染色和GAG生物合成的结果表明，6∶4组HA-ADH/PAD-RGD水凝胶更有利于维持软骨细胞表型并促进软骨形成。

4 结论

采用腙交联的可注射水凝胶，无毒、无害，生物相容性良好，且反应产物为水，不会对机体带来不良影响。可以根据需要调节多糖的质量比来改变仿生可注射水凝胶的成胶时间、力学性能和降解时间。包裹在水凝胶中的软骨细胞受到水凝胶的影响，能够更好地保持软骨细胞表型，尤其是HA-ADH/PAD-RGD质量比为6∶4的水凝胶促进软骨形成更佳，是维持软骨表型的最佳比例水凝胶。腙交联的多糖水凝胶是软骨组织工程中极具潜力的材料。

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