谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases, GSTs, E.C.2.5.1.18)是一类保守的多功能超基因家族酶系，广泛分布在真核生物和原核生物中。作为生物体内第Ⅱ阶段的酶，GSTs能够催化内源、外源有毒疏水亲电子物质与还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)结合，形成易溶于水的化合物而排出体外，减少或避免对机体造成的损伤(Rogers et al., 1999; Wongsantichon et al., 2010; Samra et al., 2012; Tan et al., 2014)。根据在细胞中的定位，GSTs主要分为胞质型(cytosolic GSTs)、微粒体型(microsomal GSTs)和线粒体型(mitochondrial GSTs)三大类。胞质型GSTs研究最为深入和广泛，昆虫胞质型GSTs包括Delta, Epsilon, Omega, Sigma, Theta, Zeta以及未分类的Unclassified亚家族，其中Delta和Epsilon亚家族为昆虫特有(余泉友等, 2010; Friedman, 2011; Tan et al., 2014)。GSTs功能多样，主要参与内源、外源有毒物质的解毒代谢，保护细胞免受氧胁迫造成损伤，参与物质合成，调节信号通路(Hayes et al., 2005)。目前对昆虫GSTs的研究主要针对杀虫剂解毒代谢和抗氧化方面(Ketterman et al., 2011)，如参与性信息素信号终止(Rogers et al., 1999)，对重金属(汞)(Yu et al., 2012)、亲电物质和农药(Espinoza et al., 2013; Zhou et al., 2015)具有解毒作用，减少氧化损伤(Zhang et al., 2013; Liu et al., 2016)。此外，还作为结构蛋白存在于昆虫间接飞翔肌中(余泉友等, 2010)。

昆虫主要通过嗅觉系统获取外界信息(信息素, 植物挥发物)决定取食、交配、产卵、躲避不利环境等行为活动。触角作为昆虫嗅觉通讯系统的主要器官，主要通过气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)感受、识别外界气味分子并将其经淋巴液转运至气味受体(olfactoryreceptors, ORs)进而引起行为反应。多余的气味分子和外源有毒物质将被气味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)降解，避免对机体造成损伤(谷少华, 2013)。气味降解酶主要包括酯酶、醛氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶、羧酸酯酶(Rogers et al., 1999; Field et al., 2000; 谷少华, 2013; 张国辉和仵均祥, 2016)。

梨小食心虫Grapholita molesta，属鳞翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)，是世界性分布的重要果树害虫之一。幼虫通过钻蛀果实或树梢危害桃Amygdalus spp.、苹果Malus spp.、梨Pirus spp.、李Prunus spp.和樱桃Cerasus spp.等蔷薇科植物，造成直接或间接损失。目前，主要依赖化学方法进行防治，但是由于梨小食心虫钻蛀性危害，防治效果较差。加之一年发生多代，需多次防治，不仅造成抗药性增加，天敌数量减少，而且导致果品农药残留和环境污染加重(张国辉等, 2012; Chen et al., 2014; 宋月芹等, 2014)。梨小食心虫具有典型的季节性寄主转移现象，触角作为接收化学信号的主要器官在定位寄主中起重要作用。而植物挥发物、外源有毒物质持续刺激会对触角造成伤害(Rogers et al., 1999; 张国辉等, 2014; 和小娟等, 2017)。目前关于梨小食心虫触角研究包括感器结构、分子识别机制，针对信号识别过程的终止、外源有毒物质解毒机制未见报道。

为了探究GSTs在梨小食心虫触角适应机制中所起的作用，本研究选取雌虫触角中一种GST基因，利用qPCR检测其在不同组织中的表达情况，并通过构建表达载体，进行原核表达，利用Western blotting检测融合蛋白，确认目的蛋白表达情况，在此基础上对酶学特征进行初步研究，以期为深入研究梨小食心虫嗅觉识别系统中GSTs的功能以及开发新型调节剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

供试昆虫：梨小食心虫幼虫采自陕西省杨凌示范区桃园(经纬度: 34°18′10″N, 108°04′38″E; 海拔: 523.0 m)，人工饲料继代饲养90余代，每年采集野外种群复壮室内种群。饲养条件：温度25±0.5℃，相对湿度70%±10%，光周期15L∶9D，光照强度4 800 lx(杜娟等, 2010)。成虫以5%的蜂蜜水补充营养，至用于实验。

主要试剂和工具酶：总RNA提取试剂盒 RNAisoTM Plus， SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ酶，限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ， T4 DNA连接酶，低分子量蛋白Marker， DL2000 DNA Marker， DL5000 DNA Marker，以及克隆载体pMD®19-T购自TaKaRa公司；Taq酶、反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、大肠杆菌Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)感受态细胞均购自天根生物技术有限公司；表达载体pET28a(+)购自Novagen公司；Ni-NTA His·Bind Resin、免疫印迹化学发光试剂(超灵敏型)购自上海七海生物科技有限公司；羊抗鼠二抗IgG(H+L)购自Jackson公司；抗His标签鼠单克隆抗体购自康为世纪有限公司；其他试剂均为国产或者进口分析纯试剂。

1.2 梨小食心虫总RNA提取和cDNA合成

收集3日龄未交配的雌雄成虫的触角(200对)、头(去除触角)(40个)、胸(25个)、腹(15个)、足(90对)和翅(80对)于无RNA酶离心管中，并在液氮保护下研磨。参照RNA提取试剂的说明书提取总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和分光度计检测RNA质量及浓度。经检测合格后，用DNaseⅠ去除基因组DNA。根据Thermo Scientific反转录试剂盒说明书合成第1链cDNA，保存在-80℃备用。

1.3 引物设计

在梨小食心虫触角转录组(GenBank登录号: SRR1424578)(Li et al., 2015)中选取一种在触角中高丰度表达的GST基因。利用Primer 5.0设计特异性引物(表1)扩增其编码区，并在编码区内设计特异性引物用于实时荧光定量(qPCR)检测该基因在不同组织中的表达情况。以梨小食心虫Actin基因为内参(GenBank登录号: JN857938)(张国辉, 2012; 宋月芹, 2014)(表1)。所需引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

从海岸潮汐流中漂来的漂流木还会被困在北太平洋的环流带中，顺着洋流漂向更远的西部。在阿拉斯加西南部的亚北极苔原地区的尤皮克人中流传的圣歌、民谣和传说中，都讲述着浮木对于当地人重要性的故事。用漂流木建造的房屋给他们提供了庇护之所，用木材燃起的篝火照亮了北极的长夜，他们还用这些漂来的木材做成了雕刻精美的萨满面具，丰富了他们的精神生活。在阿拉斯加大陆和西伯利亚之间没有树的阿留申群岛上，当地人用从太平洋西北地区漂来的黄色雪松做成盖世无双的“海豚皮船”，成为克莱默用来进行水上调研和如今体育比赛项目中所用的现代皮划艇的前身。

 

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

  

引物Primers引物序列(5'-3')Primer sequences 引物用途Primer useGST6-F1ATGGACTTGTATTACACACCG编码区扩增GST6-R1GATTAAAGTTCCTCTTTGGAAmplification of coding regionGST6-xF1CGGGATCCATGGACTTGTATTACACACCG原核表达GST6-xR1CCCAAGCTTGGGGATTAAAGTTCCTCTTTGGAProkaryotic expressionActin-F1CTTTCACCACCACCGCTGActin-R1CGCAAGATTCCATACCCA实时荧光定量PCRGST6-F2CTGGTCGCTACTGTATCTACqPCRGST6-R2GCCTCTTCATAGCCTGGA

下划线为酶切位点。The restriction sites are underlined.

1.4 梨小食心虫GST基因编码区扩增

以合成的梨小食心虫触角cDNA第1链为模板，用表1中的引物对相应的基因序列进行PCR扩增。PCR反应条件(25 μL)： 10×Ex Taq Buffer [with (NH4)2SO4] 2.5 μL, MgCl2(25 mmol/L) 2 μL, dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, Ex Taq 0.3 μL, ddH2O 16.7 μL。PCR反应条件： 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环；72℃ 10 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，纯化回收目的片段后，连接在克隆载体pMD®19-T上并转化到感受态细胞DH5α，经蓝白斑筛选，然后随机挑选5个阳性克隆，摇菌14～16 h，经菌液PCR鉴定后送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序验证。

1.5 生物信息学分析

He XJ, Xiang HM, Wang Y, Guo YF, Ma RY, 2017. Synergistic effects of volatiles from two host plants on sex-pheromones of fruit moth Grapholitha molesta (Busck) (Lepidoptera: Tortricidae). J. Shanxi Agric. Univ. (Nat. Sci. Ed.), 37(12): 854-860. [和小娟, 相会明, 王怡, 郭永福, 马瑞燕, 2017. 两种寄主植物挥发物对梨小食心虫性信息素的增效作用. 山西农业大学学报(自然科学版), 37(12): 854-860]

1.6 实时荧光定量PCR检测

将1.2节获得的梨小食心虫不同组织的cDNA稀释10倍。采用实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96TM)测定GST基因在梨小食心虫不同组织中的表达情况(Bio-Rad CFX96TM)。每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复。反应体系(20 μL): SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.8 μL, cDNA模板(200 ng/μL)1 μL, ddH2O 7.4 μL。反应条件： 95℃ 30 s； 95℃ 5 s, 59℃ 30 s, 72℃ 30 s，进行40个循环；最后59～95℃进行熔解曲线分析。以雌虫触角的比率值默认为1，相对表达量根据2-ΔΔCt对所得到的Ct值进行计算(Livak and Schmittgen, 2001)。利用SPSS19.0软件分析不同组织之间的差异(ANOVA, Tukey HSD, P<0.05)，雌雄同一组织之间进行独立样本T检验(independent-samples T test)。

1.7 梨小食心虫GST的原核表达及纯化

以雌虫触角cDNA为模板，利用带BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的特异性引物(表1)进行PCR扩增，将扩增产物连接至pMD®19-T克隆载体，然后转化到大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选取白色菌落振荡培养14～16 h，提取质粒并测序验证。经测序验证后的重组质粒pMD®19-T/GmolGST6和表达载体pET-28a(+)分别进行双酶切，切胶回收纯化后，再用T4连接酶连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用含有卡那霉素的LB平板培养基进行筛选，挑取阳性克隆培养并测序验证。

将测序正确的重组质粒pET28a(+)/GmolGST6转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂板培养后挑取阳性克隆，经菌液培养后测序鉴定。将鉴定正确的阳性克隆单菌落于LB培养基(含100 μg/mL氨苄霉素)中振荡培养(37℃ 220 r/min)。次日以1∶100(v/v)稀释到750 mL 新鲜的LB培养基继续培养，待菌液OD600=0.6～0.8时，加入IPTG(终浓度0.1 mmol/L)诱导目的蛋白表达。5～6 h后离心收集菌体，将菌体用超声波破碎，12 000 ×g离心30 min，收集上清和沉淀。

预实验表明表达蛋白为可溶。故只将上清利用Ni-NTA His·Bind Resin纯化树脂进行纯化(李广伟, 2016)，在4℃用透析袋透析去盐(透析液 20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.4)2～3次，每次2～3 h。纯化后采用BCA法对蛋白质进行定量。然后将20 μL纯化蛋白用SDS-PAGE检测，最后用等体积的50%的甘油于-20℃保存。

大家都承认科学普及出版社于2006年翻译出版的英国惠特菲尔德所著《彩图世界科技史》(原书名：History of Science；2003年出版于英国)是一本很好的科普著作.然而不管该书的作者是否具有“科普”的潜在追求，但该书的性质却明白无误的是“科学史”——正如其原书名所示：History of Science；其编写方式也是历史性的(时间顺序).科学史是一个学科、专业，但绝对不是“科普”专业.那么我们何以会将其视为一本很好的科普著作呢？

1.8 梨小食心虫GST融合蛋白的Western blot免疫印迹检测

利用半干法转膜(设置恒定电流200 V，转膜时间60 min)将5 μL蛋白从SDS-PAGE 胶上转移到PVDF膜上。用封闭液(TBST溶解的5%脱脂奶粉)对膜封闭2 h，然后用1∶8 000(v/v)倍稀释的抗His标签鼠单克隆抗体室温封闭2 h。移弃溶液后用洗脱液TBST洗膜5次，再加入1∶50 000(v/v)倍稀释的羊抗鼠二抗室温反应1 h，TBST洗脱液洗膜5次，最后加入免疫印迹化学发光试剂在UVP凝胶成像系统中显色观察。

1.9 梨小食心虫GST酶活力测定

测定方法参照Habig等(1974)并略有改进。依靠通用底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene, CDNB)和还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)在全波长酶标仪上测定目的蛋白酶活力。反应体系包括100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，1 μg目的蛋白和终浓度分别为0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5和 0.6 mmol/L的GSH。将上述混合液和10 mmol/L CDNB(避光)分别在35℃孵育15 min后，再加入20 μL CDNB，定容至200 μL。立即在340 nm下测定吸光值变化。以失活的目的蛋白为对照，每个处理重复3次。每30 s测定1次，共测定2 min，求出酶活力。

6.融入社会责任。开展“党旗领航·和谐共创”行动，围绕“爱心·宝胜”主题，群团部门相继开展“5.19慈善一日捐”、无偿献血、爱心帮扶、心灵驿站排忧解难等活动，创新救助帮扶机制和服务群众措施。

温度对重组GST蛋白酶活力的影响：反应体系包括20 μL 10 mmol/L CDNB, 20 μL 10 mmol/L GSH, 1 μg目的蛋白和100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，将反应体系分别置于10, 20, 30, 40, 50和60℃下孵育15 min，然后按照上述方法测定酶活力。

pH对重组GST蛋白酶活力的影响：在35℃下将上述反应体系100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)分别替换成不同pH梯度缓冲溶液(pH 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5和8.0为100 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.5和9.0为100 mmol/L Tris-HCl缓冲液)，按照上述方法测定酶活性。比活力计算公式如下：

比活力

其中，△OD340为单位时间内吸光度的变化值，V表示酶促反应体积(200 μL)，ε表示产物的消光系数(9.6 mmol/cm)，T表示反应时间(2 min),L表示光程(1 cm),E表示加入酶量(1 μg)。

所有数据在软件GraphPad Prism 5.0中进行分析，其中动力学方程用非线性回归(nonlinear regression)中的米氏方程(Michaelis-Menten)进行拟合。

2 结果

2.1 梨小食心虫GST基因序列分析

对梨小食心虫雌虫触角转录组测序和基因功能注释获得一种候选GST基因并进行克隆，利用传统DNA测序对转录组和测序结果中错误碱基进行校正，得到该基因的完整开放阅读框(ORF)序列，将其命名为GmolGST6(GenBank登录号: MF503496)。GmolGST6包含645 bp的ORF，编码214个氨基酸残基。预测蛋白分子量为24.21 kD，等电点为5.10，SignalP 4.1分析该基因 N端不含信号肽，属于非分泌蛋白；无跨膜区域，属于胞质型GSTs(Liu et al., 2014)。

（三）找到孩子学困的原因，对症下药。当老师了解了孩子学困的真正原因后就要帮助孩子建立学习的自信，帮助他培养良好的学习习惯，找到适合他的学习方式，促进他学习的进步。当然，这个过程不是一下两下就能实现的，也不是一天两天或者一个月两个月能完成的，更可能不是老师一个人能完成的，这就需要我们要有足够的耐心和爱心。

2.2 GmolGST6系统进化树构建

Lee SY, Lim IA, Kanga GU, Cha SJ, Altanbyek V, Kim HJ, Lee S, Kim K, Yim J, 2015. Protective effect of Drosophila glutathione transferase omega 1 against hydrogen peroxide-induced neuronal toxicity. Gene, 568(2): 203-210.

2.3 GmolGST6二级结构分析

利用ClustalX 2.1将GmolGST6与其他Detla亚家族GSTs二级结构进行比对，并经PROSITE和Conserved Domains在线分析发现，GmolGST6包含Delta亚家族的典型特征序列“TIAD”(Yan et al., 2013; Jing et al., 2017)和保守的N端和C端结构域(图2)。N端结构域位于氨基酸序列第1-80位，包含典型的β1α1β2α2β3β4α3结构，分别位于第2-5, 12-21, 28-32, 41-46, 51-56, 60-63和65-75位。具有GSH结合位点(S9-H50-T51-V52-E64-S65)和一个类似于硫氧还蛋白的结构域，与其他GSTs相似度较高；C端结构域位于第85-206位，由α4α5α6α7α8α9共6个α螺旋组成，分别位于氨基酸序列第86-100, 105-109, 122-141, 153-167, 176-188, 190-213位。具有疏水底物结合位点(L100-Y104-P105-G108-N109-Y112-F116-T161-T164-F203)，与其他GSTs相似度较低。

寻找不一样的“草本”。百雀羚确立了品牌属性即“本草护肤品”后，百雀羚接下来做的是在品牌属性的基础上进行演绎，重点是进行品牌定位以区隔佰草集、相宜本草等同属性品牌。佰草集的“自然、平衡”理念和相宜本草的“内在力外在美”理念，从严格意义上来说，是一个比较宽泛的诉求，难以形成强有力的定位。在品牌定位上百雀羚比佰草集和相宜本草更聚焦，“天然不刺激”的“温和护肤”诉求更清晰更直白，更容易被消费者理解。如果说佰草集和相宜本草耍的是品牌太极，百雀羚耍的则是品牌截拳道，更具有实战意义。

 

利用SWISS-MODEL(Schwede et al., 2003)在线搜索出与GmolGST6相似度最高的AdGST1-3(PDB ID: 1JLV.1.A)，氨基酸序列一致性为53.14%。任何一对蛋白质，若两者氨基酸序列一致性超过50%，那么约90%的α碳原子的位置不超过3 Å，即可建立理想模型(张昱等, 2008)。因此以AdGST1-3(PDB ID: 1JLV.1.A)为模板模拟GmolGST6三维结构。建模结果显示，定性模型的能量分析(Qualitative Model Energy Analysis, QMEAN)为-0.49，序列覆盖率为97%。经RAMPAGE在线检测建模质量，97%氨基酸构成的结构可信，1.5%氨基酸构成的结构存在允许范围，其余1.5%氨基酸构成的结构为不可信。一般认为若>90%氨基酸落在最适区域，建模可信度高(Lee et al., 2015)。结果如图3，GmolGST6包含典型的N端和C端结构域，N端由4个β和3个α组成 ，C端由6个α组成，二级结构元件相互之间以转角和无规则卷曲相互连接，与二级结构预测结果一致。

 

 

2.4 GmolGST6在梨小食心虫成虫不同组织中的表达量分析

 

GmolGST6基因在梨小食心虫雌雄成虫各个组织中均有表达，在触角中表达量显著高于其他组织且在雄虫触角中表达量最高(图4)。雄虫中GmolGST6基因表达量在除触角以外的头、胸、腹、足、翅之间无显著性差异。雌虫翅中GmolGST6基因表达量显著高于腹部、头部、足和胸部，而头、足和胸之间表达量无显著性差异。独立样本T检验表明，在雄虫触角和足中GmolGST6基因表达量显著高于雌虫，分别为雌虫的2.24和1.63倍。而雌虫腹部和翅中的表达量显著高于雄虫。雌雄头和胸中基因表达量无显著性差异。

2.5 GmolGST6基因重组蛋白的表达

重组表达质粒pET28a(+)/GmolGST6转入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导下成功进行表达，SDS-PAGE电泳检测发现重组酶在上清和包涵体中均有表达，根据蛋白胶中目的条带的量判断GmolGST6主要以可溶的形式存在(图5: A)。Western blot免疫印迹检测到在相应位置也产生特异性条带，说明此特异条带为目的条带(图5: B)。利用BCA法测定蛋白浓度为0.35 mg/mL。

 

2.6 GmolGST6酶学分析

样品在500 ℃空气中的氧化速率随加热时间的变化情况如图 3所示.由图3可知，在加热过程中无涂层样品一直是氧化增重的，但氧化增重速率随加热时间延长而逐渐降低.有涂层样品在加热过程中一直是减重的，但减重速率随加热时间延长而逐渐降低.这说明有涂层的样品没有被氧化，减重可能是因为涂层内水分逐渐挥发造成的.因此，涂层有一定的抗高温氧化能力和抗变色能力.

 

3 讨论

昆虫主要通过触角感受性信息素和植物挥发物等气味分子影响其行为活动，外源物质(植物挥发物、杀虫剂、除草剂、致癌物质等)会影响信号传导或对机体造成损害(Rogers et al., 1999; Tan et al., 2014)。GSTs作为三大解毒酶之一，对自身不利各种内源、外源物质具有解毒作用(赵国栋等, 2010; Tan et al., 2014)。烟草天蛾Manduca sexta 触角中GST-msolf1参与保护嗅觉系统和性信息素传导终止过程(Rogers et al., 1999)；棉铃虫Helicoverpa armigera触角中特异表达的GST-haolf可能与毒性分子的解毒和性外激素的分解有关(王桂荣等, 2003)；家蚕触角中特异表达的BmGSTD4与有毒物质的解毒有关(Tan et al., 2014)。

本研究从梨小食心虫触角转录组数据获得一种GST基因，命名为GmolGST6。进化树分析结果表明GmolGST6与BmGSTD3相似性最高，同属于Delta亚家族(图1)。Delta亚家族GSTs为昆虫特有，多个研究表明Delta亚家族在昆虫应对环境压力和氧化胁迫中起重要作用。其表达量受逆境胁迫所诱导：中华蜜蜂Apis cerana cerana AccGSTD基因在氧胁迫下表达量增加，编码的蛋白能减少活性氧对DNA造成的损伤(Yan et al., 2013)；德国小蠊Blattella germanica BgGSTD1基因是抗苄氯菊酯主要调控因子(Lin et al., 2014)；苹果蠹蛾Cydia pomonella CpGSTd1基因对毒死蜱、高效氯氟氰菊酯具有解毒作用(Liu et al., 2014)；黑腹果蝇经苯胺处理后，GSTD2，GSTD5和GSTD6基因分别在不同时间和不同剂量下的表达量发生显著变化(Chan et al., 2015)。

二级结构和三级结构的预测结果表明GmolGST6包含保守的N端和C端功能结构域，N端结构域含有与GSH结合的保守的G-site，C端结构域含有结构多样的H-site，这两个位点构成了GST的活性中心。H-site结构不保守表明GmolGST6能够结合结构多样的底物，预示GSTs的功能具有多样性(Yamamoto et al., 2012)。N端结构域的Ser是GSTs催化关键残基，其羟基与GSH的巯基通过氢键结合，通过形成硫醇盐活化GSH，活化的GSH与亲电底物结合，被还原的底物从活性位点释放，氧化胁迫解除。该氨基酸残基位点在Delta和Epsilon亚家族中高度保守(Zhang et al., 2012; 谭祥等, 2012)。氨基酸序列比对结果表明，GmolGST6中的Ser9十分保守，预测该基因具有催化GmolGST6与GSH结合的活性。

qPCR结果表明，GmolGST6基因在梨小食心虫成虫不同组织中均有表达。雌雄虫触角中的表达量显著高于其他组织，且雄虫显著高于雌虫，这与前人研究结果相似。棉铃虫GST-haolf基因和苹果蠹蛾CpomGSTd2基因在触角中特异性表达，且在雄虫中表达量高于雌虫，推测可能参与性信息素的降解过程，也可能参与毒性分子的降解(王桂荣等, 2003; Huang et al., 2017)；家蚕BmGSTD4基因在雄虫触角中特异性表达，推测与有毒物质的解毒有关(Tan et al., 2014)；柑橘凤蝶Papilio xuthus GST-pxcs1基因主要在化学感受器官中表达，可能参与寄主植物的识别过程(Ono et al., 2005)；华山松大小蠹的Dendroctonus armandi DaGSTe1基因在幼虫、蛹、成虫中均有表达，且在雄性成虫中高丰度表达，推测DaGSTe1参与不同发育阶段的解毒过程，还可能参与性信息素的转运(马俊宁等, 2015)。同时，序列分析表明GmolGST6序列不含信号肽，属胞质型GSTs，不分泌到细胞外，因此GmolGST6基因在不同组织中的表达水平体现该酶在梨小食心虫体内的分布情况，进而可以推测其发挥作用的部位。GmolGST6基因在触角中表达量显著高于其他部位，据此推测GmolGST6可能参与性信息素挥发物或有毒物质降解。雌虫翅中的表达量显著高于头、胸、腹、足，这与张学尧等(2012)研究结果一致，可能由于飞行过程中产生大量代谢产物，部分有害代谢产物积累可能形成氧胁迫，翅中GmolGST6可能有助于维持氧平衡，减轻机体损伤。腹部GmolGST6基因表达量显著高于头、胸、足，这与张学尧等(2012)和Huang等(2017)研究结果相似。腹部的中肠是重要的解毒器官，分布于腹部的GmolGST6可能一定程度上参与了解毒作用。GmolGST6基因在腹、足、翅之间存在显著差异，是否在这些组织中存在一定的生理功能，还有待进一步鉴定。

Schwede T, Kopp J, Guex N, Peitsch MC, 2003. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res., 31(13): 3381-3385.

本研究首次研究了梨小食心虫触角中GST基因，获得GmolGST6完整的开放阅读框和氨基酸序列，并分析了其二级结构和三维结构。GmolGST6符合典型的Delta亚家族GSTs特征。对GmolGST6进行体外重组表达和纯化，并对纯化的蛋白进行了酶活性分析，证明了GmolGST6具有解毒功能，GmolGST6具体对哪些物质具有解毒作用还需进一步研究。该结果为研究梨小食心虫触角适应机制以及鳞翅目的防治提供了理论依据。

参考文献 (References)

Chan WC, Chien YC, Chien CI, 2015. Aniline exposure associated with up-regulated transcriptional responses of three glutathione S-transferase Delta genes in Drosophila melanogaster. Environ. Toxicol. Pharmacol., 39(2): 622-627.

现如今，我党反腐“零容忍”，即便是退休了的官员，倘有贪腐劣迹照查不误，这使得“官程”有了延续。有些官员退休后“发挥余热”，利用在任时的关系和影响力牟取私利，大搞“期权腐败”，如江苏省原常委、秘书长赵少麟在卸任7年11个月后被查，广州市国土房管局原副局长谭丽群退休11年后被查，获刑13年，彻底粉碎了他们“退休=平安着落”梦。

利用模式底物CDNB和GSH测定GmolGST6的动力学参数(图6: A)，结果表明：重组蛋白GmolGST6具有催化CDNB的活性， Km为0.21±0.06 mmol/L， Vmax为14.02±1.40 μmol/min·mg。GmolGST6在40℃时的相对酶活力最高。10～40℃之间，相对酶活力随温度的升高逐渐增加；40～60℃之间随温度的升高相对酶活力逐渐降低，60℃孵育15 min后酶活力仅为40℃时酶活力的26.8%(图6: B)。GmolGST6在pH 7.5时酶活力最高，pH 5.0～7.5时随pH升高酶活力逐渐提高；pH 7.5～9.0随pH增加而降低；pH 9.0时，仅为pH 7. 5时酶活力的8.9%(图6: C)。

Chen H, Xu XL, Li YP, Wu JX, 2014. Characterization of heat shock protein 90, 70 and their transcriptional expression patterns on high temperature in adult of Grapholita molesta (Busck). Insect Sci., 21(4): 439-448.

从磐安实施的工程情况看，该技术适宜黏土、亚黏土、砾石土、风化岩及弱风化岩等，硬度较大的基岩除效率略低以外也可使用。在铺管材料的选择上可选范围也较大，在弯孔中可铺设柔性管(如PVC、PE管等)、在直孔中除可铺设柔性管道外，也可铺设刚度较大的管材（如钢管、铸铁管等）；铺设管径与长度可根据需要进行选择。磐安县工程地层大多为风化岩或弱风化岩，本次山塘整治铺设管道均采用DN250PE管，铺设长度约40 m～60 m，工程在实施过程中较为顺利。

Du J, Wang YR, Wu JX, 2010. Effect of four different artificial diets on development and reproduction of Grapholitha molesta (Lepidoptera: Tortricidae). J. Shanxi Agric. Univ. (Nat. Sci. Ed.), 30(3): 228-231. [杜娟, 王艳蓉, 仵均祥, 2010. 不同饲料配方对梨小食心虫生长发育及繁殖的影响. 山西农业大学学报(自然科学版), 30(3): 228-231]

Espinoza HM, Shireman LM, McClain V, Atkins W, Gallagher EP, 2013. Cloning, expression and analysis of the olfactory glutathione S-transferases in coho salmon. Biochem. Pharmacol., 85(6): 839-848.

Field LM, Pickett JA, Wadhams LJ, 2000. Molecular studies in insect olfaction. Insect Mol. Biol., 9(6): 545-551.

Friedman R, 2011. Genomic organization of the glutathione S-transferase family in insects. Mol. Phylogenet. Evol., 61(3): 924-932.

Gu SH, 2013. Molecular and Cellular Basis of Sex Pheromone Communication in the Black Cutworm Moth Agrotis ipsilon. PhD Dissertation, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. [谷少华, 2013. 小地老虎性信息素通讯的分子和细胞机制. 北京: 中国农业科学院博士学位论文]

Habig WH, Pabst MJ, Jakoby WB, 1974. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem., 249(22): 7130-7139.

Hayes JD, Flanagan JU, Jowsey IR, 2005. Glutathione transferases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 45: 51-88.

利用NCBI在线程序ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框(ORF)；利用在线程序(http:∥isoelectric.ovh.org/)预测理论pI/Mw；采用在线软件SignalP 4.1 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽；利用在线BLAST工具(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索相似性序列用于构建梨小食心虫与其他昆虫GSTs系统发育进化树。在ClustalX 2.1软件中使用默认参数进行全序列比对(Do Complete Alignment)。然后采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发育树，所用软件为MEGA 6.0，自展值重复抽样1 000次，替代模型为p-distance，比对空位采用完全删除(Complete deletion)。最后使用Photoshop CC 2017对进化树进行特殊标记；运用在线工具Conserved Domains(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析保守结构域，经ClustalX 2.1序列比对后使用GeneDoc 2.7.0进行标记；运用SWISS-MODEL在线网站(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)搜索同源蛋白，选取相似性最高的大劣按蚊Anopheles dirus GST1-3的晶体结构(PDB ID: 1jlv.1.A, 解析度1.75 Å)作为GmolGST6的模板(序列一致性为53.14%)，使用默认参数在线自动建模。在RAMPAGE网站绘制拉马钱德兰图(the Ramachandran Plot)检测所模拟蛋白结构，并用PyMOL 1.3r1软件作图。

Huang XL, Fan DS, Liu L, Feng JN, 2017. Identification and characterization of glutathione S-transferase genes in the antennae of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae). Ann. Entomol. Soc. Am., 110(4): 409-416.

Jing TX, Wu YX, Li T, Wei DD, Smagghe G, Wang JJ, 2017. Identification and expression profiles of fifteen delta-class glutathione S-transferase genes from a stored-product pest, Liposcelis entomophila (Enderlein). Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 206: 35-41.

Ketterman AJ, Saisawang C, Wongsantichon J, 2011. Insect glutathione transferases. Drug Metab. Rev., 43(2): 253-265.

为了进一步明确GmolGST6与其他昆虫GSTs蛋白之间的进化关系，通过BLAST搜索了埃及伊蚊Aedes aegypti、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、家蚕Bombyx mori、致倦库蚊Culex quinquefasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和东亚飞蝗Locusta migratoria GST基因所对应的氨基酸序列，并结合梨小食心虫GmolGST6基因氨基酸序列，经ClustalX 2.1序列比对后，利用MEGA 6.0软件的邻连法构建系统发育树。结果(图1)表明，GSTs被划分为6个亚家族(Delta, Epsilon, Theta, Zeta, Omega, Sigma)以及一个未分类的Unclassified亚家族。不同亚家族的GSTs蛋白各自聚成小类群，说明GSTs在进化上相对保守。相同亚家族的GSTs又形成不同分支，表明GST蛋白进化上的差异性。GmolGST6与BmGSTD3 (GenBank登录号： NP_001037546.1)聚在同一进化分支，亲缘关系近，同源性高，氨基酸序列一致性为63.18%。一般认为氨基酸序列一致性高于40%的GSTs归属于同一类(马俊宁等, 2015)，故推测GmolGST6属于典型的Delta亚家族。

Ma JN, Dai LL, Zhang RR, Chen H, 2015. Cloning and expression of glutathione S-transferase gene DaGSTe1 of Dendroctonus armandi. J. Northwest A&F Univ. (Nat. Sci. Ed.), 43(8): 116-122, 132. [马俊宁, 代鲁鲁, 张然然, 陈辉, 2015. 华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因DaGSTe1的克隆与表达. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 43(8): 116-122, 132]

青萝站在一旁，闻听此言，立即插言道：“两个脉？是有身孕了吗？”少女快言快语，当着屋中众人，直将“身孕”二字说了出来，丝毫不知避讳。

Li GW, Du J, Li YP, Wu JX, 2015. Identification of putative olfactory genes from the oriental fruit moth Grapholita molesta via an antennal transcriptome analysis. PLoS ONE, 10(11): e0142193.

Lin YH, Lee CM, Huang JH, Lee HJ, 2014. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol., 65(1): 45-50.

Liu J, Yang X, Zhang Y, 2014. Characterization of a lambda-cyhalothrin metabolizing glutathione S-transferase CpGSTd1 from Cydia pomonella (L.). Appl. Microbiol. Blotechnol., 98(21): 8947-8962.

Liu S, Liu F, Jia H, Yan Y, Wang H, Guo X, Xu B, 2016. A glutathione S-transferase gene associated with antioxidant properties isolated from Apis cerana cerana. Sci. Nat., 103(5-6): 43.

Livak KJ, Schmittgen TD, 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct methods. Methods, 25(4): 402-408.

Li GW, 2016. Molecular Mechanisms of Recognition of Host Plant Volatiles in Grapholita molesta Busck. PhD Dissertation, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi. [李广伟, 2016. 梨小食心虫识别寄主植物挥发物的分子机制. 陕西杨凌: 西北农林科技大学博士学位论文]

Ono H, Ozaki K, Yoshikawa H, 2005. Identification of cytochrome P450 and glutathione S-transferase genes preferentially expressed in chemosensory organs of the swallowtail butterfly, Papilio xuthus L. Insect Biochem. Molec. Biol., 35(8): 837-846.

Rogers ME, Jani MK, Vogt RG, 1999. An olfactory-specific glutathione-S-transferase in the sphinx moth Manduca sexta. J. Exp. Biol., 202(12): 1625-1637.

脱敏治疗即特异性免疫治疗，是针对致敏花粉而采取的对因治疗措施，这种治疗方法可以做到有的放矢，临床效果较好，不良反应也很少。1998年世界卫生组织认定了这是种高质量的标准化的脱敏治疗方法，对过敏性哮喘及过敏性鼻炎具有确切的疗效。

Samra AI, Kamita SG, Yao HW, Cornel AJ, Hammock BD, 2012. Cloning and characterization of two glutathione S-transferases from pyrethroid-resistant Culex pipiens. Pest Manag. Sci., 68(5): 764-772.

为了进一步明确GmolGST6基因的功能，经异源原核表达获得纯化的GmolGST6蛋白。预测蛋白分子量为24.21 kD，SDS-PAGE和Western blot检测结果与预测结果一致，说明表达产物并没有经过很大的加工修饰。重组蛋白GmolGST6在40℃、pH 7.5条件下表现出最高活性，这与其他昆虫GSTs的最适条件相似(Yamamoto et al., 2005, 2006, 2011)。CDNB作为不溶性、有毒化合物，是检测GSTs是否具有解毒作用的模式底物(Tan et al., 2014)。GmolGST6表现出催化CDNB的活性，且Vmax远大于BmGSTD(Vmax为0.52 μmol/min·mg)(Yamamoto et al., 2012)和LmGST1(Vmax为0.621 μmol/min·mg)(Zhang et al., 2012)。证实了重组GmolGST6具有良好的解毒功能。结合基因组织表达情况，推测GmolGST6在触角解毒过程中起着重要作用。

Song YQ, 2014. Cloning, Prokaryotic Expression and Functional Analysis of Pheromone Binding Protein Relative Genes from the Oriental Fruit Moth, Grapholita molesta (Busck). PhD Dissertation, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi. [宋月芹, 2014. 梨小食心虫Grapholita molesta (Busck)信息素结合蛋白相关基因的克隆、原核表达及功能分析. 陕西杨凌: 西北农林科技大学博士学位论文]

Song YQ, Xie XC, Dong JF, Wu JX, 2014. cDNA cloning, expression profiling and binding properties of odorant-binding protein GmolOBP3 in the oriental fruit moth, Grapholita molesta (Lepidoptara: Tortricidae). Acta Entomol. Sin., 57(3): 274-285. [宋月芹, 解幸承, 董钧锋, 仵均祥, 2014. 梨小食心虫气味结合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表达谱及结合特性分析. 昆虫学报, 57(3): 274-285]

Tan X, Hu XM, Zhong XW, Chen QM, Xia QY, 2014. Antenna-specific glutathione S-transferase in male silkmoth Bombyx mori. Int. J. Mol. Sci., 15(5): 7429-7443.

Tan X, Nie HY, Liu C, Hu XM, Chen QH, Liu RF, Zhao P, Xia QY, 2012. Tissue-specific expression, sequence characteristics and enzyme activity, assay of recombinant protein of Bombyx mori glutathione S-transferase E4 gene. Sci. Sericul., 38(4): 624-633. [谭祥, 聂红毅, 刘春, 胡晓明, 陈全梅, 刘茹凤, 赵萍, 夏庆友, 2012. 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶E4基因的组织表达和序列特征及重组蛋白的酶活性分析. 蚕业科学, 38(4): 624-633]

[2]介绍了在柱面坐标下的一个投影法，即将积分区域投影到极坐标面上，将三重积分转化为先一后二的积分，再将外层的二重积分转化为二次积分，最终实现将三重积分转化为三次积分。

随后根据细过滤器滤料要求，从仓库调拨合适粒径的细石榴石，粗石榴石，无烟煤3种滤料，对细过滤器进行彻底的清罐防腐，对集水器分水器结构进行了检查并按照设计滤料厚度更换滤料。滤料更换完成后，注水系统恢复正常（图3）。

Wang GR, Guo YY, Wu KM, 2003. Cloning of cDNA frangment of an antennal-specific gene in Helicoverpa armigera. Chin. J. Agric. Biotech., 11(1): 49-54. [王桂荣, 郭予元, 吴孔明, 2003. 一个棉铃虫触角特异表达基因cDNA片段的克隆. 农业生物技术学报, 11(1): 49-54]

Wongsantichon J, Robinson RC, Ketterman AJ, 2010. Structural contributions of Delta class glutathione transferase active-site residues to catalysis. Biochem. J., 428(1): 25-32.

Yamamoto K, Hirofumi I, Yoichi A, Banno Y, Kimura M, Nakashima T, 2011. Molecular characterization of an insecticide-induced novel glutathione transferase in silkworm. Biochim. Biophys. Acta, 1810(4): 420-426.

Yamamoto K, Usuda K, Kakuta Y, Kimura M, Higashiura A, Nakagawa A, Aso Y, Suzuki M, 2012. Structural basis for catalytic activity of a silkworm Delta-class glutathione transferase. Biochim. Biophys. Acta, 1820(10): 1469-1474.

Yamamoto K, Zhang PB, Banno Y, Fujii H, 2006. Identification of a sigma-class glutathione-S-transferase from the silkworm, Bombyx mori. Appl. Entomol., 130(9-10): 515-522.

Yamamoto K, Zhang PB, Miake F, Kashige N, Yoichi A, Banno Y, Fujii H, 2005. Cloning, expression and characterization of theta-class glutathione S-transferase from the silkworm, Bombyx mori. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 141(3): 340-346.

Yan HR, Jia HH, Wang XL, Gao HR, Guo XQ, Xu BH, 2013. Identification and characterization of an Apis cerana cerana Delta class glutathione S-transferase gene (AccGSTD) in response to thermal stress. Naturwissenschaften, 100(2): 153-163.

Yu QY, Fang SM, Zuo WD, Zhang Z, Lu C, 2010. Molecular cloning, sequence analysis and tissue expression characterization of glutathione S-transferase gene BmGSTzl in Bombyx mori. Acta Entomol. Sin., 53(10): 1061-1068. [余泉友, 房守敏, 左伟东, 张泽, 鲁成, 2010. 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因BmGSTz1的克隆、序列分析及组织表达特征. 昆虫学报, 53(10): 1061-1068]

Yu XL, Sun RJ, Yan HR, Guo XQ, Xu BH, 2012. Characterization of a sigma class glutathione S-transferase gene in the larvae of the honeybee (Apis cerana cerana) on exposure to mercury. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 161(4): 356-364.

Zhang GH, 2012. Molecular Characterizations and Prokaryotic Expression of Olfactory Related Genes in Grapholita molesta (Busck). PhD Dissertation, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi. [张国辉, 2012. 梨小食心虫嗅觉相关蛋白基因的分子生物学特性及其原核表达研究. 陕西杨凌: 西北农林科技大学博士学位论文]

Zhang GH, Liu YF, Wu JX, 2012. cDNA cloning, sequence analysis and prokaryotic expression of a chemosensory protein from the oriental fruit moth, Grapholita molesta (Lepidoptera: Tortricidae). Acta Entomol. Sin., 55(6): 668-675. [张国辉, 刘彦飞, 仵均祥, 2012. 梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达. 昆虫学报, 55(6): 668-675]

Zhang GH, Song YQ, Tian XL, Wu JX, 2014. Ultrastructure of antennal sensilla of oriental fruit moth, Grapholitha molesta. J. Northwest A&F Univ. (Nat. Sci. Ed.), 42(10): 51-56, 62. [张国辉, 宋月芹, 田晓丽, 仵均祥, 2014. 梨小食心虫触角感器的超微结构. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 42(10): 51-56, 62]

Zhang GH, Wu JX, 2016. Cloning and prokaryotic expression of general odorant binding protein 2 cDNA from oriental fruit moth, Grapholita molesta. J. Northwest A&F Univ. (Nat. Sci. Ed.), 44(6): 111-115, 124. [张国辉, 仵均祥, 2016. 梨小食心虫普通气味结合蛋白2(GmolGOBP2) cDNA的克隆与原核表达. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 44(6): 111-115, 124]

(2)管子在正断层有内压工况下的变形有2种，当内压较小时发生拉伸变形，当内压大于一定值时发生弯曲变形。

Zhang XY, Li T, Zhang JQ, Li DQ, Guo YP, Qin GH, 2012. Structural and catalytic role of two conserved tyrosines in Delta-class glutathione S-transferase from Locusta migratoria. Arch. Insect Biochem Physiol., 80(2): 77-91.

Zhang XY, Wang JX, Guo YQ, Zhang JZ, Ma EB, 2012. Cloning, sequence analysis and expression profiling of glutathione S-transferase omega 1 gene from Locusta migratoria (Orthoptera: Acridoidea). Acta Entomol. Sin., 55(5): 520-526. [张学尧, 王建新, 郭艳琼, 张建珍, 马恩波, 2012. 飞蝗谷胱甘肽S-转移酶基因克隆、序列分析及表达特征. 昆虫学报, 55(5): 520-526]

Zhang Y, Wang YL, Zhang YG, Fan L, Fang YZ, Liu LK, Jiang ST, Lü JL, Zhang ZW, Zhang SG, Li ZF, Du JX, 2008. Three-dimensional structure modeling and functional analysis of 3D polymerase of foot-and-mouth disease virus strain AF72. Chin. Veter. Sci., 38(10): 842-846. [张昱, 王永录, 张永光, 潘丽, 方玉珍, 刘力宽, 蒋守田, 吕建亮, 张中旺, 张淑刚, 李正丰, 杜进鑫, 2008. 口蹄疫病毒AF72株3D聚合酶的三维结构模拟和功能分析. 中国兽医科学, 38(10): 842-846]

Zhang YY, Yan HR, Lu WJ, Li YZ, Guo XQ, Xu BH, 2013. A novel Omega-class glutathione S-transferase gene in Apis cerana cerana: molecular characterisation of GSTO2 and its protective effects in oxidative stress. Cell Stress Chaperones, 18(4): 503-516.

Zhao GD, Wei ZG, Zhang YL, Gao RN, Wang RX, Zhang T, Li B, Shen WD, 2010. Quantitative analysis of induced expression of GST gene in the wild mulberry silkworm, Bombyx mandarina. Acta Entomol. Sin., 53(2): 216-220. [赵国栋, 卫正国, 张轶岭, 高瑞娜, 王瑞娴, 张婷, 李兵, 沈卫德, 2010. 野桑蚕谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)基因的诱导表达定量分析. 昆虫学报, 53(2): 216-220]

Zhou L, Fang SM, Huang K, Yu QY, Zhang Z, 2015. Characterization of an epsilon-class glutathione S-transferase involved in tolerance in the silkworm larvae after long term exposure to insecticides. Ecotoxicol. Environ. Saf., 120: 20-26.