昆虫免疫系统被分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫通过产生抗菌肽(Lowenberger, 2001)、活性氧与活性氮(Bogdan et al., 2000)，并通过复杂的酚氧化酶原级联系统，在血淋巴中进行黑化反应(Gillespie et al., 1997; Cerenius and Soderhall, 2004)，从而发挥防御外源物入侵的功能。细胞免疫包括由昆虫血细胞进行的吞噬(phagocytosis)、结节(nodulation)以及包囊(encapsulation)反应(Strand and Pech, 1995; Schmidt et al., 2001; Kamaladevi et al., 2017)。鳞翅目昆虫的血细胞在形态学上可分为浆细胞(plasmatocytes, PL)、粒细胞(granulocytes, GR)、珠血细胞(spherule cells, Sph)、类绛色细胞(oenocytoids, OE)以及原血细胞(prohemocytes) (Butt and Shields, 1996)。在鳞翅目昆虫中，浆细胞与粒细胞占所有血细胞50%以上，在有外源物刺激的情况下浆细胞与粒细胞能够发生粘附作用，是昆虫细胞免疫反应的主力(Lackie, 1988; Strand and Pech, 1995; Blanco et al., 2017)。珠血细胞被认为在表皮物质运输方面起作用(Sass et al.,1994)，类绛色细胞中富含酚氧化酶前体，被认为在黑化反应中起作用(Ashida and Dohke, 1980; Iwama and Ashida, 1986; Dubovskiy et al., 2016)。原血细胞具有干细胞功能，可以分化成一种或几种上述类型的血细胞(Gardiner and Strand, 2000; Lanot et al., 2001; Majumder et al., 2017)。

鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)的部分昆虫是冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis的宿主昆虫，二者形成的虫菌复合体即为冬虫夏草。冬虫夏草是名贵的中药材，具有抗肿瘤、抗过敏以及免疫调节等功能(Ng and Wang, 2005; Zhou et al., 2009; Hu et al., 2013)，在经济和药用价值上具有重要地位。目前对于冬虫夏草菌寄主蝙蝠蛾的血细胞，特别是细胞免疫方面的研究仍为空白，研究蝙蝠蛾血细胞及其细胞免疫，不仅可以为冬虫夏草的人工培植提供理论指导，也有助于昆虫细胞免疫学的发展。

本研究以小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensis 7龄幼虫为研究对象，通过形态学观察来鉴定小金蝠蛾幼虫血细胞类型，并对不同类型的血细胞进行计数，计算不同血细胞在小金蝠蛾血淋巴中的所占比例。同时利用不同外源物的刺激，探究小金蝠蛾细胞免疫的功能。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

小金蝠蛾原始种群来源于四川省阿坝藏族羌族自治州小金县，已在中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室昆虫病毒学研究组实验室内饲养3代 ，饲养温度13±2℃，相对湿度60%～80%，幼虫期与蛹期于黑暗条件下饲养，成虫期于14L∶10D光周期条件下饲养。

1.2 实验用菌株

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae由中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室昆虫病毒学研究组提供。

充分利用应用型本科院校已经设立的创业实训室(比如创客空间、电商产业园、创业实训基地和孵化器等)给通过电子商务课程教学过程中和过程后成型的电商创业团队提供孵化空间，并聘请企业代表为讲师，为学生提供营销、财务、法律等方面的相关知识，以提高创业项目孵化的成功率。这样一来，不仅能激发学生的学习兴趣，提高教学效果，还能燃起学生的创业热情，使学生实现创业梦想，从而达到减轻就业压力的终极目标。

1.3 主要试剂及器材

Ringer’s生理盐水配制：NaCl 8.05 g, KCl 0.42 g, CaCl2 0.18 g, 双蒸水定容至1 L，HCl与NaOH调至pH 7.4。过饱和PTU-Ringer’s生理盐水配制：将过量的苯基硫脲(PTU)加入Ringer’s(pH 7.4)中，震荡、溶解后备用。2.5%戊二醛固定液购自Leagene公司。1% Congo Red染液配制：Congo Red粉剂10 mg用双蒸水定容至10 mL。DEAE-Sephadex A-25凝胶珠(干粉型)购自Sigma公司。96孔细胞培养板购自NEST公司。

1.4 小金蝠蛾幼虫血细胞常规涂片制作与观察

取小金蝠蛾7龄幼虫血淋巴2 μL与1 μL过饱和PTU-Ringer’s生理盐水混匀滴于载玻片上，用盖玻片缓慢覆盖载玻片上血淋巴液滴，用吸水纸吸走多余溢出的液体，于正置光学相差显微镜(Leica, 德国)下观察各类血细胞形态并鉴定。

moeaine in Qiongkushtai JING Guang-xiu WU Shao-ying(13)

1.5 小金蝠蛾幼虫各类血细胞所占比例统计

分别向96孔细胞培养板的6个孔板中注入Ringer’s生理盐水(每孔170 μL)以及过饱和PTU-Ringer’s生理盐水上清液(每孔20 μL)，吹打混匀。取6头健康小金蝠蛾7龄幼虫，各取10 μL血淋巴分别注入上述6个孔板中，轻轻吹打混匀，置13℃细胞培养箱(Memmert, 德国)，使血细胞沉降孵育1 h。对6个孔板中各类血细胞进行随机视野计数，并计算各类血细胞所占百分比。

1.6 小金蝠蛾幼虫血细胞的细胞免疫吞噬功能检测

分别向96孔细胞培养板的6个孔板中注入Ringer’s生理盐水(每孔160 μL)、过饱和PTU-Ringer’s生理盐水上清液(每孔20 μL)以及酿酒酵母菌液(每孔10 μL， Ringer’s生理盐水菌悬液1.0×104 个/mL)。取6头健康小金蝠蛾7龄幼虫，各取10 μL血淋巴分别注入上述6个孔板中，轻轻吹打混匀，置13℃细胞培养箱(Memmert, 德国)，共孵育2 h。于倒置光学相差显微镜(Leica, 德国)下观察小金蝠蛾幼虫血细胞吞噬酵母细胞的过程。

1.7 小金蝠蛾幼虫血细胞的细胞免疫形成结节功能检测

Bogdan C, Rollinghoff M, Diefenbach A, 2000. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Curr. Opin. Immunol., 12(1): 64-76.

北极航线长约5600公里，穿越了北冰洋和白令海。因为该航线能将亚洲和欧洲之间的航行时间最多缩短两周，所以近年来这条航线的交通量在日益增长。如马士基、阿联酋航运、中远和现代商船等航运公司的部分船只都选择了北极航线。

1.8 小金蝠蛾幼虫血细胞的细胞免疫形成包囊功能检测

取DEAE-Sephadex A-25凝胶珠(干粉型)20 mg加入2 mL 1% Congo Red染液中染色5 min，用蒸馏水洗去多余染液，离心(2 000 g 5 min)弃上清，向沉淀Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠加入Ringer’s生理盐水1 mL，制成Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠Ringer’s生理盐水悬液，4℃冰箱保存备用。分别向6头健康的7龄小金蝠蛾幼虫注射30～50粒Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠，1 h以及12 h后解剖被注幼虫(各解剖3头)，取出Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠，于倒置光学相差显微镜下观察小金蝠蛾幼虫血细胞包囊形成情况。

2 结果

2.1 小金蝠蛾幼虫血细胞形态

显微观察小金蝠蛾幼虫血细胞表明，其血细胞类型与其他鳞翅目昆虫一致(图1: A)，在形态学上可分为粒细胞、浆细胞、类绛色细胞和珠血细胞。其中粒细胞(图1: B)为圆形或卵圆形，直径约为10～12 μm，贴壁后一段时间可延展出片状伪足和丝状伪足，但细胞质仍为圆形或卵圆形，细胞质内富含黑色颗粒内含物；浆细胞(图1: C)未延展时为圆形、卵圆形或梭形，直径约为10～12 μm，贴壁后一段时间可延展出片状伪足和丝状伪足，细胞质往往形变为梭形或不规则形状，延展后长距为15～20 μm，宽距为6～12 μm，细胞质内也有黑色颗粒内含物；类绛色细胞(图1: D)为圆形或卵圆形，有时也有不规则形状，直径约为20～30 μm，不可延展，贴壁能力差，细胞质混沌均一，细胞核染色质一般成浓缩状态，此细胞极易破裂溶胞，并向血淋巴中释放内含物；珠血细胞(图1: E)往往被内涵物小球填充成不规则形状，但大体呈卵圆形，直径约为12～25 μm，不可延展，贴壁能力差，除了内含物小球外，几乎看不到细胞质。体外培养时，细胞膜会破裂释放出内含物小球。血细胞在孔板中孵育初期(图1: A)，粒细胞与浆细胞的形态难以区别，需要孵育1 h以上，待两类细胞延展后，方可容易识别与鉴定。在小金蝠蛾血淋巴中并未发现典型的原血细胞。

2.2 小金蝠蛾幼虫各类血细胞所占比例

小金蝠蛾7龄幼虫各类血细胞在总血细胞中所占比例分别为粒细胞62.5%±5.65%，浆细胞26.6%±3.39%，珠血细胞10.1%±2.56%，类绛色细胞0.8%±0.75%(图2)。粒细胞所占比例最高，达62.5%，粒细胞和浆细胞所占比例高达89%，表明这两种血细胞在小金蝠蛾血淋巴的细胞免疫功能中发挥主要作用，同时也暗示细胞免疫在小金蝠蛾免疫系统中可能发挥重要作用。

2.3 小金蝠蛾幼虫血细胞的细胞免疫体外吞噬功能

Gardiner EMM, Strand MR, 2000. Hematopoiesis in larval Pseudoplusia includens and Spodoptera frugiperda. Arch. Insect Biochem., 43(4): 147-164.

1)截割头静止视觉测试。截割头静止情况下，每100 ms采集1张图片，共采集78张图片，对所采集图片的处理结果如图10所示。图10a为抬升角处理结果，图10b为回转角处理结果。

 

 

Dubovskiy IM, Kryukova NA, Glupov VV, Ratcliffe NA, 2016. Encapsulation and nodulation in insects. Invertebr. Surv. J., 13: 229-246.

 

2.4 小金蝠蛾幼虫血细胞的细胞免疫形成结节功能

 

2.5 小金蝠蛾幼虫血细胞的细胞免疫形成包囊功能

将Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠注入小金蝠蛾7龄幼虫体内，分别在注射1 h和12 h后解剖虫体，观察血细胞对凝胶珠的细胞免疫反应。注射Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠1 h后，大量血细胞粘附在其表面(图6: A)，注射Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠12 h后，随着更多血细胞不断一层层地包被，Congo Red-DEAE-Sephadex A-25凝胶珠最终被多层血细胞包被，形成包囊(图6: B)，并且包囊内的Congo Red-DEAE-Sephadex A-25已完全被黑化，包囊的多层血细胞包被呈现面纱状(veil-like)。该结果表明，小金蝠蛾细胞免疫针对大型外源物可以发生包囊反应。

3 讨论

本研究通过形态学观察，对小金蝠蛾7龄幼虫血细胞进行了分类与鉴定，并统计了各类血细胞的所占比例。分别利用酿酒酵母与Congo Red-DEAE-Sephadex A-25，体外和体内刺激小金蝠蛾幼虫血细胞，以此检测其细胞免疫功能是否完善。

小金蝠蛾的血淋巴中所占比例最高的是粒细胞，其所占比例高达62.5%，高于其他已报道鳞翅目昆虫粒细胞所占比例的平均水平。推测粒细胞在小金蝠蛾的细胞免疫中起主要作用。由于蝠蛾是鳞翅目昆虫中进化上最原始的种系(Nielsen et al., 2000)，推测粒细胞在鳞翅目昆虫细胞免疫系统中可能是最早出现，并对外源物具有防御与清除作用的主要血细胞类型。

小金蝠蛾各类血细胞形态学界限清晰，容易识别与鉴定，其中粒细胞为球形或卵圆形，可延展出片状伪足和丝状伪足， 但延展后整体细胞仍为球形或卵圆形，并存在黑色颗粒内含物；浆细胞为球形、卵圆形或梭形，可延展出片状伪足和丝状伪足，延展后为纺锤形或不规则形状，并也存在黑色颗粒内含物；类绛色细胞体积最大，不可延展，细胞质于光学相差显微镜下混沌均一，体外容易破裂溶胞并向血淋巴释放内含物；珠血细胞成不规则形状，胞质中充满内含物小球。该观察结果基本符合Lavine和Strand(2002)对鳞翅目昆虫血细胞的分类和描述。血细胞在孔板孵育初期，浆细胞与粒细胞从形态学上难以识别与鉴定，需孵育1 h以上，待浆细胞与粒细胞爬片延展后方容易识别与鉴定。本研究并未鉴定出已报道典型的原血细胞，可能是由于原血细胞具有干细胞功能，在血淋巴中含量极低，对原血细胞的识别与鉴定仍需进一步探索。

 

 

联立标量方程(7)和方程(8)，代入某些三角恒等式简化方程组，可以求出 θ3 和 θ4。第1步重写方程(7)和方程(8)，把其中一个未知数θ3先分离到方程的左边，求解θ4。

小金蝠蛾细胞免疫功能完善，在酿酒酵母的刺激下，可正常发生吞噬与结节。在吞噬过程(图3)中，小金蝠蛾幼虫血细胞首先延伸出丝状伪足捕获酿酒酵母，将酿酒酵母拉拽至细胞膜边缘将其吞噬，说明小金蝠蛾幼虫血细胞丝状伪足的形成，对细胞免疫吞噬功能十分重要。在结节形成过程中，小金蝠蛾幼虫血细胞受到酵母刺激后，初期(1 h左右)能够形成较多的可游离于血淋巴中的结节，12 h后结节附着于脂肪体上，此时血淋巴中观察不到游离的结节，同时血淋巴中的血细胞也大幅减少，推测大部分血细胞被消耗，用于大量结节的形成并被脂肪体捕获。进一步暗示，在小金蝠蛾的细胞免疫中，脂肪体参与了结节反应。在Congo Red-DEAE-Sephadex A-25的刺激下，小金蝠蛾幼虫血细胞对大型外源物可正常发生包囊反应。由于体外实验的限制，难以捕获结节与包囊形成的动态现象，对于细胞免疫功能结节与包囊中，血细胞的作用顺序与机制尚不明确，仍需进一步探索。

Lanot R, Zachary D, Holder F, Meister M, 2001. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev. Biol., 230(2): 243-257.

参考文献 (References)

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各牧草品种EE含量年际变化不显著(P>0.05)，月变化极显著(P<0.01)。2014年和2015年2年平均以星星草EE含量最低为1.10%，其次为垂穗披碱草(1.42%)、青海草地早熟禾(1.48%)、同德老芒麦(1.51%)、青海中华羊茅(1.52%)，7月牧草EE含量最高，8月次之，9月牧草EE含量最低。随着生长时间的延长，牧草EE含量逐渐降低(图 5)。

分别向6头健康7龄小金蝠蛾幼虫微量注射5 μL酿酒酵母菌液(Ringer’s生理盐水菌悬液1.0×108 个/mL)。注射酿酒酵母菌液1 h后取注菌幼虫血淋巴，12 h后解剖注菌幼虫取得脂肪体，于正置光学相差显微镜下观察结节形成情况。

采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行处理，计数资料以百分数（%）表示，采用x2检验；计量资料以“±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

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Cerenius L, Soderhal K, 2004. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immunol. Rev., 198(1): 116-126.

发生吞噬作用。体外共孵育24 min时有少量酿酒酵母已被血细胞吞噬，可观察到血细胞伸出丝状伪足捕获酿酒酵母(图3: A)；34 min时可观察到酿酒酵母被血细胞丝状伪足拉拽至细胞膜边缘(图3: B)；44 min时可观察到酿酒酵母被完全吞噬进入血细胞细胞质中(图3: C)，整个吞噬过程持续大约20 min。

将小金蝠蛾幼虫血淋巴、饱和PTU-Ringer’s生理盐水与酿酒酵母悬液一起加入96孔细胞培养板中，轻轻吹打混匀后于倒置光学相差显微镜下观察，并进行延时拍照(拍照间隔时间：2 min)，体外跟踪观察血细胞对外源物(酿酒酵母)的细胞免疫反应。结果发现，小金蝠蛾幼虫血细胞对酿酒酵母敏感，可向小金蝠蛾7龄幼虫微量注射酿酒酵母1 h后，观察到酿酒酵母可诱导小金蝠蛾幼虫血细胞发生结节反应，大量浆细胞与粒细胞多层次包被数个酿酒酵母，且包被中的酿酒酵母发生黑化现象(图4)，此时有较多结节游离于血淋巴中。向小金蝠蛾微量注射酿酒酵母12 h后,可以观察到大量黑化的结节附着在脂肪体上(图5: A)，在血淋巴中已观察不到游离结节，并且血淋巴中血细胞数量稀少，甚至观察不到血细胞。取脂肪体上的黑色结节，用尖头镊子夹碎，并于正置光学相差显微镜下观察(图5: B)，发现黑化的结节中有较多聚集在一起被黑化的酿酒酵母。

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（18）詢婆元因，各申所屬，婆眷忽相繼損世。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經註》卷二，《中华道藏》30/548）

综上所述，本研究通过形态学手段鉴定了小金蝠蛾幼虫血细胞种类，并对各类血细胞进行了所占比例统计，初步检测了小金蝠蛾细胞免疫功能，表明小金蝠蛾幼虫血细胞可以正常发生吞噬、结节以及包囊3种细胞免疫反应，细胞免疫功能完善，为后续研究小金蝠蛾与冬虫夏草菌的免疫互作奠定了基础。

小虫又想，姑父看上去冷若冰霜，其实内心是很疼爱自己的。明知自己偷了他钻戒，竟一直没说，也没报案。如果姑父报案了，小虫肯定要坐牢，连玉敏都要受牵累。

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铅碳电池储能系统厂家通常拥有具备回收资质的成员公司，负责产品的回收、冶炼，实现能源再生，把对资源的能耗降至最低。铅的直收率由传统工艺80%～85%提升至98%以上，实现节能减排、资源循环综合利用。铅碳电池在达到使用寿命之后，由铅碳电池厂家负责上门回购，回收价格约为电池售价的20%～30%。

Sass M, Kiss A, Locke M, 1994. Integument and hemocyte peptides. J. Insect Physiol., 40(5): 407-421.

3.3 脊髓损伤者对排尿处理费用的认识 表2显示，有15.8%脊髓损伤者担心长期间歇导尿耗材费用大。其实，损伤早期规范的使用间歇导尿，有利于膀胱功能的恢复，随着残余尿量的减少，可以减少导尿次数;间歇导尿还能明显减少尿路感染等并发症的发生，耗材费用相比治疗并发症的费用低;且近年来，我国对康复医疗越来越重视，康复治疗的耗材有望纳入医保范围。医务人员要关心脊髓损伤者的生理、心理及社会层面的需求，鼓励家人多与脊髓损伤者相处，应该为脊髓损伤者提供社会活动的条件、环境，鼓励社区脊髓损伤者参加“中途之家”等;通过社会和单位及街道帮困捐助，爱心人士的捐赠，基本医疗保险的不断健全，以解决脊髓损伤者的后顾之忧。

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