许多生物活性物质(如药物、香料和功能活性物质等)都是以单一的对映体形式存在，并广泛应用于医药、香料等行业，因此，获得光学活性化合物至关重要[1]。相对于传统的有机催化，酶法催化动力学拆分获得光学活性化合物，由于作用条件温和、立体选择性高和环境友好等优势发展较快[2]。但许多酶在催化过程中需要辅酶的参与，从而阻碍了这些酶在体外催化的应用[3]。

光学活性仲醇是合成一些复杂天然产物的手性中心，作为重要的手性砌块用于精细化工药物中间体的合成[4]。常用于动力学拆分仲醇的酶有氧化还原酶和脂肪酶。氧化还原酶由于较低的活力、需要辅酶的参与、在有机溶剂和无溶剂体系中较差的稳定性等限制了氧化还原酶的发展[5]；而脂肪酶由于催化无需辅酶、立体选择性良好、底物范围广、在非水相(如有机溶剂、离子液体和超流体)中活力稳定[6-8]等优势得到广泛研究。其中，南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B，CALB)是一种用于手性拆分仲醇的高效催化剂[9]。细胞表面展示技术是将表达蛋白锚定在细胞表面上，简化了蛋白纯化和固定化步骤，工业应用价值非常大[10]。细胞表面展示脂肪酶用于手性拆分已有报道[11-13]。黑曲霉(Aspergillus niger)作为一种常用的蛋白表达系统，适合于食品和药品的生产，并被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为通常认为安全(generally regarded as safe，GRAS)范围的微生物[14]。

作者所在课题组已将黑曲霉表面展示CALB制备的全细胞催化剂AN-CALB用于合成己酸乙酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯和硬脂酸异丙酯等[15-16]，在此将AN-CALB用于催化仲醇动力学拆分，以进一步拓宽其应用领域。

1 实验

1.1 试剂

2-戊醇、2-辛醇、R-2-辛醇、S-2-辛醇、1-苯乙醇、对硝基苯酯(pNPEs)，阿拉丁公司；3-庚醇、4-甲基苯基-1-乙醇、4-氯苯基-1-乙醇、4-溴苯基-1-乙醇、4-甲氧基-α-甲基苄基醇，上海赢瑞生物医药科技有限公司；相应的酯根据O′Neill等[17]方法化学合成和纯化；其它化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 AN-CALB的制备

旅游者离开自己生活的“第一空间”而到异地的“第二空间”进行休闲，其动机往往是放松，且周围多是陌生人，因此对自身的要求以及对规则的遵循产生弱化，其结果就是对身的行为有无意识的降低要求，于是，就有了在客源地并不常见的不文明行为，如随地扔垃圾、穿着不得体、大声喧哗等。

采用气相色谱(Agilent 7890A，美国)配备氢火焰离子化检测器(FID)检测所有产物。检测条件：氮气为载气，流速1 mL·min-1，分流比30∶1，Cyclodex-B色谱柱(Agilent 112-2532,美国)和CP-Chirasil-Dex CB色谱柱(Varian CP7502，美国)。

1.2.2 AN-CALB 催化仲醇动力学拆分

综上所述，理论上，具备海外背景的独立董事可以有效提高企业现金持有的水平。在信息大爆炸的时代，一个人的知识素养和能力经验决定了他的高度。独立董事如果拥有海外背景，那么他们也就被自动默认为拥有了这两项技能。聘用他们有利于董事会有效发挥职能并且提高公司内部治理水平。我国自从提出建设创新型国家后，出台了多种吸引海外优秀人才回国就业的优惠政策，这也促进更多的上市公司有机会去聘请具有海外经历的独立董事，从而为企业注入新鲜血液。

取适量仲醇、酰基供体和AN-CALB于50 mL磨口具塞锥形瓶中，加入正己烷溶液至10 mL，50 ℃、200 r·min-1反应12 h，取样检测。通过测定底物的减少量来计算底物转化率(C)，并按下式计算底物或产物的对映体过量值(ee)和反应的对映体比值(E)，用来衡量反应的拆分能力。

 

(1)

 

(2)

 

(3)

式中：R、S分别表示R型、S型对映体的含量；ees为底物的对映体过量值;eep为产物的对映体过量值。

实验数据为3组平行实验的平均值，用Excel软件进行统计分析，以均值±标准差(x±sd)表示。

活化并发酵重组黑曲霉得到A.niger/CALB-CwpA，用pH值8.0的50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲溶液洗涤3次，重悬菌体，加入1%的海藻糖作为冻干保护剂，真空冷冻干燥24 h，即得AN-CALB粉末，平衡水含量，待用[15]。

综上所述，针对偏瘫性肩关节周围炎，主治医师可以应用肩痛穴平衡针灸治疗方式，并且此针灸方式具有操作简单和容易掌握的特点，并且针灸穴位相对较少，降低了针灸意外事故的发生概率[10-12]。相比较而言，传统的针灸方式需要选择的穴位较多，在缓解患者疼痛感的同时，有极大的概率引发新的疼痛。最关键的是，肩痛穴平衡针灸治疗方式具有明显的治疗效果，能够缓解患者的疼痛感，再加上具有应用安全性高等特点，适合被广泛应用在临床医学中，是一种行之有效的针灸治疗方式。

1.2.4 数据统计分析方法

1.2.3 气相色谱分析

2 结果与讨论

2.1 酰基供体对AN-CALB催化仲醇动力学拆分的影响

AN-CALB催化仲醇动力学拆分是一个酰化过程，是形成底物仲醇酶中间体的过程。酰基供体对酶催化仲醇拆分过程的反应速率和立体选择性都有重要影响[18-19]，从而影响其拆分效果。分别以乙酸乙烯酯、乙酸、乙酸酐、乙酸乙酯和乙酸异丙烯酯为酰基供体，将100 mg AN-CALB[水活度(aw)为0.11]、12 mmol 2-辛醇、18 mmol 酰基供体溶于正己烷溶液中，总体积为10 mL，200 r·min-1、50 ℃反应12 h，考察酰基供体对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响，结果见图1。

4.培训需求预测分析的方法具有多样性。企业培训必须采用多种方法进行综合分析，才能获得准确的培训需求，进而保证培训具有合理性、针对性和有效性。

  

图1 酰基供体对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响Fig.1 Effect of acyl donors on resolution of2-octanol catalyzed by AN-CALB

由图1可以看出，以乙酸酐作为酰基供体反应12 h时，虽然可以达到较高的底物转化率(44.66%)，但其eep和E值很低，仅为7.20%和1.22，表明以乙酸酐作为酰基供体时，AN-CALB的底物立体选择性受到抑制，而且影响较大。以乙酸异丙烯酯或乙酸乙烯酯为酰基供体时的底物转化率均高于以乙酸和乙酸乙酯为酰基供体时的底物转化率，这可能是由于，醇与烯酯发生转酯反应时，可以释放醛气体，从而导致反应不可逆进行[18]；以乙酸异丙烯酯作为酰基供体反应12 h时的底物转化率、eep和E值都较高，分别为17.69%、99.00%和245.08。因此，选择乙酸异丙烯酯作为酰基供体。

水活度在有机相条件下是影响酶催化反应的关键参数之一[18]。将AN-CALB粉末分别置于不同的饱和盐水合物(LiCl、MgCl2、Mg(NO3)2、NaNO3、K2SO4、H2O，水活度分别为0.11、0.33、0.54、0.74、0.97、1.00)中保存72 h，平衡水分，然后将500 mg不同水活度的AN-CALB、12 mmol 2-辛醇、12 mmol 乙酸异丙烯酯溶于正己烷溶液中，总体积为10 mL，200 r·min-1、50 ℃反应9 h，考察水活度对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响，结果见图4。

由图5可以看出，随着温度的升高，底物转化率逐渐升高，E值逐渐增大，eep值基本不变；从45 ℃升到50 ℃，底物转化率未有明显提高，升高到55 ℃，底物转化率仅提高3%。因此，基于能效考虑，选择温度为45 ℃。

2.2 仲醇与酰基供体物质的量比对AN-CALB催化仲醇动力学拆分的影响

仲醇与酰基供体物质的量比会影响AN-CALB催化反应的速度、反应的平衡点。以乙酸异丙烯酯为酰基供体，将100 mg AN-CALB(aw=0.11)、12 mmol 2-辛醇、乙酸异丙烯酯溶于正己烷溶液中，总体积为10 mL，200 r·min-1、50 ℃反应12 h，考察2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响，结果见图2。

由图4可以看出，随着水活度的增加，底物转化率略微降低，E值略有减小，eep值变化不大；当水活度为0.11时，底物转化率、eep和E值最大，分别为33.49%、99.00%和327.28。这可能是由于，在水活度为0.11的条件下，AN-CALB处于催化作用所必需的最佳构象。通常酶分子周围紧密结合着一层必需水，水分子可以屏蔽酶分子内部极强的基团间的静电作用，使酶分子有足够的柔性，处于催化作用所必需的构象状态。而过高的水活度会导致细胞聚集，从而影响传质，微量的水分在维持酶结构和构象方面起着重要的作用。因此，选择水活度为0.11。

  

图2 2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响Fig.2 Effect of molar ratio of 2-octanol to isopropenylacetate on resolution of 2-octanol catalyzed by AN-CALB

2.3 AN-CALB添加量对AN-CALB催化仲醇动力学拆分的影响

在AN-CALB催化仲醇拆分过程中，增加AN-CALB添加量可以显著缩短时间，但同时会增加成本，合适的AN-CALB添加量至关重要。分别将不同量的AN-CALB(aw=0.11)、12 mmol 2-辛醇、12 mmol 乙酸异丙烯酯溶于正己烷溶液中，总体积为10 mL，200 r·min-1、50 ℃反应9 h，考察AN-CALB添加量对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响，结果见图3。

  

图3 AN-CALB添加量对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响Fig.3 Effect of AN-CALB addition onresolution of 2-octanol catalyzed by AN-CALB

由图3可以看出，当AN-CALB添加量从10 g·L-1增加到60 g·L-1时，底物转化率从15.55%提高到39.34%，E值从237.92增加到387.50，eep值保持在99.00%。根据脂肪酶拆分2-辛醇的“乒乓”机制，脂肪酶结合酰基供体并释放一个残基，留下一个取代酶，然后该取代酶再结合2-辛醇和释放出第二个产物，最后脂肪酶恢复到它的初始状态。由于酶的立体选择性不会随着用量的改变而改变，酶量会在一定的范围内达到饱和，并在这范围之后拆分效率变化不大。考虑到拆分效率和成本因素，同时也考虑到AN-CALB添加量过多时，底物和产物的扩散会受到限制，因此，选择AN-CALB添加量为50 g·L-1。

2.4 水活度对AN-CALB催化仲醇动力学拆分的影响

（2）叠前道集资料的精细预处理是提高AVO检测精度的关键。叠前道集资料处理必须进行高保真度、高信噪比和高分辨率的处理，尤其不能破坏地震振幅的相对关系。

氯化浸金试验中，氯化钠的作用是和被氯酸钠氧化后的金作用生成[AuCl4-] ，以达到浸出金的作用。为了确定最佳氯化钠用量，本文采用单因子变量原则，考察了不同氯化钠用量下金的浸出率。氯化钠(mol/L)：0.5、0.8、1.0、1.2；氯酸钠：16 g/L；稀硫酸：3.0 mol/L；矿浆浓度：25%；温度：80℃；时间：2 h。不同氯化钠用量试验结果如图8所示。

  

图4 水活度对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响Fig.4 Effect of water activity on resolutionof 2-octanol catalyzed by AN-CALB

由图2可以看出，2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5时，底物转化率分别为18.72%、17.69%、16.12%、15.34%,eep值均为99.00%,但E值逐渐减小。这可能是因为，乙酸异丙烯酯浓度的提高对酶活性有一定的抑制作用。因此，选择2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比为1∶1，此时的底物转化率、eep和E值分别为18.72%、99.00%和248.72。

2.5 温度对AN-CALB催化仲醇动力学拆分的影响

温度会影响酶的三维结构，从而影响酶的催化能力。将500 mg AN-CALB(aw=0.11)、12 mmol 2-辛醇、12 mmol 乙酸异丙烯酯溶于正己烷溶液中，总体积为10 mL，在不同温度(40～65 ℃)下200 r·min-1反应6 h，考察温度对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响，结果见图5。

  

图5 温度对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响Fig.5 Effect of temperature on resolutionof 2-octanol catalyzed by AN-CALB

瓷器画上构图，需要去掌握新彩的独特料性，装饰手法上也可以拜托很多工艺上的局限性，这样会给装饰带来很多自由随性且灵动感十分强烈的绘画风格，从而也能形成自己独特绘画风格。由于不同的装饰对象，所以对于表现手法也要根据不同题材来做改变。当对新彩料性有一定程度掌握，那绘画的起稿也能较为灵活的变动。从而使料可以适应自我的感官表达，达到最理想的表达手法。

2.6 溶剂对AN-CALB催化仲醇动力学拆分的影响

溶剂不仅会影响酶的活力还会影响其立体选择性[20]。将500 mg AN-CALB(aw=0.11)、12 mmol 2-辛醇、12 mmol 乙酸异丙烯酯溶于不同有机溶剂(乙腈、四氢呋喃、异丙醚、甲苯、正己烷、庚烷、辛烷，脂水分配系数logP分别为0.33、0.49、1.70、2.50、3.50、4.00、4.50)中，总体积为10 mL，200 r·min-1、45 ℃反应9 h，考察溶剂对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响，结果见图6。

  

图6 溶剂对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响Fig.6 Effect of solvent on resolutionof 2-octanol catalyzed by AN-CALB

由图6可以看出，在不同溶剂中，随着溶剂脂水分配系数的增大，底物转化率先升高后降低，E值也是先增大后减小；以甲苯(脂水分配系数为2.50)为溶剂时，底物转化率和E值均最高；而eep值除以四氢呋喃为溶剂时较小外，在其它溶剂中均变化不大。这可能是由于，AN-CALB存在疏水区域，有机溶剂极性过强时，活性部位上的肽链会发生翻转，脂肪酶与底物的反应通道关闭，使催化活性大大降低，当乙腈与四氢呋喃作为溶剂时，底物转化率较低；而正己烷、庚烷、辛烷三者的极性较小，通道处于打开状态，和活性部位形成一个较大的疏水区域，有利于有机溶剂参与进行催化拆分反应；但是由于AN-CALB的活性部位有部分亲水基团，极性过小反而会导致反应速率减慢。而甲苯由于极性适中，此时AN-CALB的活性较高，能有效地催化2-辛醇拆分反应。因此，选择甲苯为溶剂。

综上，确定AN-CALB催化仲醇拆分的最优反应条件为：以乙酸异丙烯酯为酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比1∶1、AN-CALB添加量50 g·L-1、水活度0.11、温度45 ℃、以甲苯为溶剂。

靖远县是已知甘肃省境内现存甘草野生资源存量较大、分布较集中的地区，但由于缺乏有效保护，仍有野生甘草不断遭遇人为盗挖，野生资源的利用已十分有限，因此研究甘草的人工栽培和积极鼓励甘草的人工种植具有重要意义。甘草种子直播不易萌发，研究甘草育苗移栽技术已显十分重要，但是不同播种期育苗生产的苗木大小、生物量等方面都有所不同，为了找到最佳的育苗播种期，2015年在靖远县永新乡永新村开展了甘草不同播种期比较试验，以找出适合靖远当地育苗的最佳播种期，为丰富甘草育苗技术的理论基础及其生产实践提供依据。

2.7 AN-CALB催化8种仲醇动力学拆分

在最优反应条件下，将AN-CALB应用于8种仲醇(24 mmol)动力学拆分，结果见表1。

表1 AN-CALB催化8种仲醇动力学拆分

 

Tab.1Kinetic resolution of eight sec-alcohols catalyzed by AN-CALB

  

sec-alcoholsproducttime/hees/%eep/%C/%E2-戊醇 R690.8a99.647.7>6002-辛醇 R1289.6a99.647.4>6003-庚醇 R3621.9a99.918.0>6001-苯乙醇 R3665.999.939.3>6004-甲基苯基-1-乙醇 R3681.199.943.7>6004-氯苯基-1-乙醇 R3694.999.948.5>6004-溴苯基-1-乙醇 R2493.099.947.0>6004-甲氧基-α-甲基苄基醇 R3692.997.848.8311.3

注：a为根据公式(2)计算得到的ees值。

由表1可以看出，AN-CALB对8种仲醇都有很好的立体选择性，除4-甲氧基-α-甲基苄基醇外，大部分仲醇的E值都大于600、eep值大于99%；AN-CALB催化脂肪仲醇(2-戊醇、2-辛醇)拆分的速度比拆分芳香仲醇要快，说明AN-CALB更适合于催化拆分较短的支链仲醇，可能与CALB具有较深窄的催化活性中心口袋有关[21]，但AN-CALB催化3-庚醇拆分的速度比2-辛醇慢，这可能是由于CALB的“M”口袋限制了比正丙基更大的分子空间[22]；AN-CALB催化8种仲醇的拆分产物都是R型，这符合Kazlauskas准则[23]；AN-CALB催化8种仲醇都表现出了良好的拆分效果，底物转化率最高接近50%。

3 结论

微生物细胞表面展示酶是绿色生物制造技术的新兴研究热点，是一种非常有潜力的生物催化剂。本研究利用黑曲霉表面展示CALB制备全细胞催化剂AN-CALB，以2-辛醇为底物，研究了酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比、AN-CALB添加量、水活度、温度和溶剂对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响，确定最优反应条件为：以乙酸异丙烯酯为酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比1∶1、AN-CALB添加量50 g·L-1、水活度0.11、温度45 ℃、以甲苯为溶剂，在此条件下，反应12 h的底物转化率达47.4%，eep值为99.6%,E值大于600。在最优反应条件下，AN-CABL对8种仲醇都表现出较好的拆分效果，底物转化率最高接近50%。该研究拓宽了黑曲霉表面展示CALB的应用领域，为动力学拆分仲醇的制备提供了新途径。

儿童来生信念与父母来生信念得分以及死亡话题亲子谈话的相关矩阵如表5所示。BA量表总分与儿童来生信念总分有显著负相关，说明父母越相信存在死后生活，他们的孩子越倾向认为死后功能继续。PDCA量表总分与知觉问题、情绪问题、愿望问题以及儿童来生信念测量的总分有显著负相关，说明父母与儿童谈论死亡时的越多地使用描述死后生活、心理状态的词汇，他们的孩子越倾向认为死后功能继续。

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