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玛咖次生代谢物提取分离研究进展(下)

更新时间:2009-03-28

玛咖,学名Lepidium meyenii Walp.,独行菜属十字花科植物,原产于秘鲁安第斯山区[1-2],含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖等营养物质和玛咖生物碱、芥子油苷、异硫氰酸苄酯等次生代谢活性物质,有强身健体、延缓衰老、提高免疫力、抗疲劳等功效[3-13],在云南丽江、迪庆州有大面积种植,在云南会泽、昭通,新疆塔什库尔干、乌恰、且末,西藏曲水、琼结,青海都兰、贵德,四川攀枝花、凉山等地也有少量种植。目前,我国已成为世界第一大玛咖产区。

随着玛咖的广泛种植和生理活性功能受到认可,玛咖次生代谢物的提取分离将变得非常重要,但此方面的系统报道还比较少见。基于此,作者对玛咖次生代谢物的提取分离进行了归纳与梳理,对其质量评价体系在国内的发展情况予以简要介绍,并对玛咖的下一步发展及其深加工予以展望,为进一步研究玛咖提供参考依据。

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1 玛咖生物碱、玛咖酰胺提取分离方法

1.1 玛咖生物碱提取分离方法

玛咖生物碱作为玛咖次生代谢物中一种非常重要的化合物,是存在于玛咖体内的一类含氮的碱性有机物,主要包括玛咖酰胺和玛咖烯、羟基吡啶衍生物类、β-咔啉类、咪唑类等几大类生物碱,具有非常重要的生理活性,有抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤和增强生育力的功能[7-8]。目前,玛咖生物碱主要以纯水、酸水、醇、酸性醇以及脂类溶剂等为提取剂,配以浸渍法、渗漉法、煎煮法、热回流法和索氏提取法等传统方法以及超声波法、微波法、超临界萃取法、离子交换法等现代新技术提取。

1.1.1 溶剂提取法

玛咖次生代谢物的提取分离主要还是以溶剂提取法为主,超声波法、微波法或者超临界萃取法等比较新颖的技术对各次生代谢物的提取有一定的促进作用,但提高幅度却有着较大差异,在实际工业化生产中,还有着较大的应用局限性。玛咖甾醇、玛咖酰胺等次生代谢物的纯化主要还是以柱层析、结晶法为主,辅以超临界色谱法等高新技术。

姜月蒙等[14] 在水浴中以超纯水为溶剂提取丽江玛咖粉2 h,调节pH值(滤液用20%氨水调节pH值至7.6,水相用10% NaOH调节pH值至12.0),氯仿萃取得到玛咖总生物碱,在料液比1∶20(g∶mL,下同)、温度70 ℃、时间100 min的最优提取工艺下,玛咖总生物碱得率为1.58%。但王婧等[15]几乎用同样的方法提取玛咖总生物碱,其得率仅为0.84%,其原因可能与不同产地、批次的原料所含生物碱多少有关,也可能与两者调节pH值不同有关。Zha等[16]用pH值4.5的盐酸水溶液或者盐酸乙醇溶液在料液比1∶10的条件下提取玛咖2次,每次90 min,再经过喷雾干燥(进料流速400 mL·min-1,进风温度165 ℃)得玛咖生物碱,得率为74.7%,生物碱含量为0.21%。溶剂提取法提取条件温和,但提取生物碱效率偏低,适合玛咖生物碱初步提取。

1.1.2 超声波法、微波法

Dini等[37]使用二氯甲烷提取秘鲁玛咖,硅胶柱吸附层析,二氯甲烷洗脱,后处理制得玛咖甾醇,含有β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、麦角二烯等化合物,其中β-谷甾醇、菜油甾醇含量分别占总甾醇的45.5%和27.3%。由于甾醇的脂溶性特性,研究者尝试用不同的脂溶性溶剂来提高甾醇得率。郑茜等[38]利用吸附法将吉林玛咖根茎水提,石油醚、氯仿萃取,萃取液经硅胶柱色谱分离,石油醚-醋酸乙酯(25∶1→1∶1)反复洗脱,三氯甲烷溶解结晶得β-谷甾醇。杜萍等[39]将丽江玛咖干根茎粉碎,分别用75%乙醇、50%乙醇回流提取,石油醚萃取,无水硫酸钠脱水,减压硅胶柱吸附层析,以石油醚-乙酸乙酯(8∶2→2∶8)梯度洗脱,收集4~6流分,减压浓缩,甲醇反复溶解结晶得β-谷甾醇。

1.1.3 其它方法

植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为骨架的天然醇类化合物,科学家们誉其为“生命的钥匙”,虽然其含量很低,但具有非常重要的生理功能。玛咖中的甾醇主要有β-谷甾醇、麦角固醇、Δ7,22-麦角二烷醇、菜籽甾醇和菜油甾醇等,其中β-谷甾醇含量较高,这些化合物可能是玛咖能调节内分泌、降低胆固醇、改善性功能、抗氧化的原因之一[35-36]。甾醇的相对密度略大于水,不溶于水,可溶于多种有机溶剂。常用甾醇提取纯化方法有:溶剂提取法、溶剂结晶法、吸附法、皂化法、超临界萃取法、酶法、分子蒸馏法等。

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1.2 玛咖酰胺提取分离方法

从上述玛咖生物碱、酰胺类化合物的提取分离可以看出,玛咖生物碱及酰胺类化合物不具有典型的生物碱特性,其含量受提取分离方法及玛咖品种、产地、营养成分、次生代谢物等多种情况的影响。

Muhammada等[29]将玛咖用石油醚浸提、氯仿萃取所得的提取物注入快速硅胶色谱柱(40 μm,120 g),用正己烷、30%~70%乙酸乙酯梯度洗脱,再通过薄层层析分离得到1,2-二氢-N-羟基吡啶、N-苄基十六烷酰胺、N-苄基-5-羰基-(6E,8E)-十八碳二烯酰胺等4种玛咖酰胺。Ganzera等[30]用甲醇作溶剂在超声场下提取秘鲁利马玛咖干根粉,利用硅胶色谱柱(Synergi Max-RP 80 Å C12色谱柱,150 mm×4.6 mm,4 μm)分离,在40 ℃柱温下,以含0.025% 三氟乙酸的纯水和含0.025% 三氟乙酸的乙腈梯度洗脱得到5种玛咖酰胺。Cui 等[31]从玛咖块根浸出物中分离出1,3-二苯甲基-2,4,5-三甲基-咪唑啉氯酰胺和1,3-二苯甲基-4,5-二甲基-咪唑啉氯酰胺2种咪唑生物碱,并认为两者具有选择性对抗人类癌细胞的细胞毒素活性。

春季遇到阴雨寡照天气,要小心灰霉病和霜霉病,闷热天气小心白粉病和蓟马,尤其是夏秋季,霜霉病可能更难防控。

超临界色谱法是以超临界流体作流动相,依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程,具有比高效液相色谱更高的效率、更短的分析时间,也被用于分离纯化玛咖酰胺。潘云等[34]将干玛咖粉放入超临界CO2萃取仪中,以 95% 乙醇作夹带剂萃取得玛咖超临界CO2提取物,石油醚萃取,减压浓缩,加水溶解,上D101型大孔吸附树脂柱(1.5 cm×12 cm),依次用水、30%乙醇、95%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱液,浓缩,甲醇溶解,再通过超临界色谱柱(Shim-pack UC-X RP色谱柱,250 mm×4.6 mm,5 μm)分离,以超临界CO2-无水乙醇梯度洗脱,在柱温45 ℃、压力10 MPa、流速3 mL·min-1时,N-苄基十六烷酰胺和N-(3-甲氧基-苄基)-(9Z,12Z)-十八烷二烯酰胺得到较好分离。

玛咖酰胺主要包括N-苄基亚油酰胺、N-苄基亚麻酰胺和N-苄基棕榈酰胺,具有抗氧化、抗疲劳活性,与能量代谢调节、脂肪代谢调节、糖代谢调节有关,是玛咖生物碱中活性物质之一[25-28]。目前,玛咖酰胺类单体化合物常用的分离及分析鉴定方法主要包括柱色谱分离、薄层色谱法、高效液相色谱法及超临界色谱法等。

2 玛咖甾醇及其衍生物提取分离方法

玛咖的脂溶性生物碱可通过石油醚、乙酸乙酯等极性较弱的脂溶性溶剂配合回流法、渗漉法、超声波法或者多种方法联合等手段来提取。杨秦[22]将玛咖干根粉加入 12倍体积的石油醚中,50 ℃下回流提取30 min,再超声波提取15 min,获得含玛咖酰胺(20%)和微量玛咖烯的脂溶性生物碱,得率为1.96%。郭谦亮等[23]分别用石油醚、乙酸乙酯浸泡不同产地、不同部位玛咖粉3 h后,在600 Hz超声波下提取30 min,浓缩提取液,石油醚和乙酸乙酯的出膏率分别为0.6%和0.4%,真空干燥得玛咖总生物碱提取物。唐燕文等[24]比较了不同浓度乙醇溶液在回流提取、常温振摇、超声波提取、超临界CO2提取及乙醇-水联合回流等方法下提取丽江玛咖中有效成分(主要为玛咖烯、玛咖酰胺)的得率,结果表明,乙醇-水联合回流提取法、乙醇回流提取法、常温振摇法、超临界CO2提取法和超声波提取法的得率分别为4.4%、3.8%、3.8%、3.3%和3.2%。这个结果可能与采用乙醇和水联合提取时,玛咖中的脂溶性和水溶性成分全面地被提取出来有关。

杜广香[17]用pH值2.0的盐酸水溶液在70 ℃加热浸提玛咖粉末(料液比1∶30)5 h,玛咖生物碱得率为4.08%;再用含2%盐酸的90%乙醇溶液在80 ℃、料液比1∶30的条件下回流提取玛咖60 min,玛咖生物碱得率为4.52%;并和用90%乙醇溶液超声波提取生物碱工艺比较,发现乙醇超声波提取法对玛咖生物碱的提取率高于酸水浸提法和酸醇回流法。罗堾子等[18]以云南栽培玛咖为原料,以含0.5%盐酸的95%乙醇溶液为溶剂,通过超声波和微波的协同作用得到提取液,再经过调节pH值、氯仿萃取得玛咖总生物碱,在料液比1∶60、微波功率 352 W、作用时间 1.2 min、超声波功率300 W的优化工艺条件下,总生物碱含量较传统的索氏提取法含量高 8.7%。王未等[19]将玛咖粉和95%乙醇溶液按料液比1∶40混合,然后置于循环超声波提取设备中,当超声波密度、温度和时间分别为333.3 W·L-1、40 ℃、60 min时,所得玛咖生物碱的含量达最高值5.787 mg·g-1。玛咖总生物碱在酸性环境下以盐的形式存在,在水中溶解度较大,加之,超声波的空化效应、机械效应、热效应以及微波的高能作用更能进一步促进玛咖生物碱向液体中扩散、溶解,从而加快提取进程,提高效率[20-21]

由于玛咖酰胺种类繁多,结构比较相似,往往需要多次处理才能获得纯度较高的产物。室温下,Zhao等[32]以95% 乙醇连续提取孟菲斯玛咖干根粉得到玛咖总碱粗提物,己烷萃取后上硅胶色谱柱,乙酸乙酯-氯仿梯度洗脱,再经薄层色谱纯化得N-苄基-9-羰基-12Z-十八碳烯酰胺、N-苄基-9-羰基-(12Z,15Z)-十八碳二烯酰胺、N-苄基-13-羰基-(9E,11E)-十八碳烯酰胺、N-苄基-15Z-二十四烷酰胺、N-(3-甲氧基苄基)-十八烷酰胺等5个玛咖酰胺类单体化合物。室温下,Chain等[33]用正己烷通过索氏提取器提取阿根廷玛咖干根粉得浓缩浸膏,甲醇溶解,烧碱除去脂肪酸酯类化合物后,碳酸酐乙酰化 24 h,上硅胶色谱柱(230~300目),正己烷-乙酸乙酯(5∶1)洗脱,薄层层析分离得纯脂肪酸酰胺洗脱液,再上Phenomenex Luna C18色谱柱 (250 mm×10 mm,5 μm),以含0.1% 三氟乙酸的纯水和含0.1% 三氟乙酸的乙腈为流动相梯度洗脱,分离得到N-(4,5-二甲氧基苄基)-十六碳酰胺、N-苄基二十四碳酰胺2个玛咖酰胺。

甾醇纯化除了使用硅胶吸附层析法外,还可使用溶剂萃取法、结晶法、皂化法等,有些新技术能使玛咖甾醇的纯度更高。甘瑾等[40] 在80 ℃水浴下以石油醚索氏提取云南3种色型(红、紫、黄)玛咖6~8 h,用氢氧化钾-甲醇溶液在85 ℃水浴下皂化1 h,冷却,饱和氯化钠溶液-正己烷萃取,无水硫酸钠脱水,浓缩,微滤膜过滤得玛咖甾醇。结果显示,白、紫、黄玛咖中甾醇总量分别是 36.60 mg·(100 g)-1、32.38 mg·(100 g)-1和27.97 mg·(100 g)-1,其主要成分分别为β-谷甾醇和菜油甾醇。唐伟敏等[41]用超临界CO2萃取西藏玛咖粉80 min,在50 ℃、30 MPa的条件下获得低极性组分,用氢氧化钾-甲醇溶液在80 ℃ 下皂化 1 h,石油醚萃取,吸取有机层,无水硫酸钠脱水,UPLC-PDA 检测出甾醇含量为254.82 μg·g-1,分别为β-谷甾醇、岩藻甾醇、菜油甾醇和豆甾醇,其中β-谷甾醇占甾醇总量的77.84%。尽管分子蒸馏法、酶法等新方法具有高效性和高选择性,但在玛咖甾醇的提取中还是以溶剂结晶法、吸附法等传统方法为主。

3 玛咖质量评价标准建立进展

2004年,云南会泽引入美国玛咖开始栽培,引种成功后,玛咖种植面积迅速扩大,2015年,仅丽江种植面积已超14万亩[42],产业规模达到数十亿元,丽江占全国种植面积的60%。与种植面积、市场火热形成对照的是,玛咖产业没有相关国家标准,造成真假难辨、优劣不分、品种混杂、市场混乱。在此情况下,云南省卫生厅批准丽江检测中心承担云南省食品安全地方标准玛咖及其制品的制定工作,2015年8月颁布了适用于玛咖干果、干片及玛咖粉的《云南省食品安全地方标准 玛咖干制品》(DBS 53/001-2015)[43-44],这是我国第一个关于玛咖的安全质量标准,为规范玛咖产业市场、玛咖原料与产品进出口提供标准依据。该标准对玛咖水分、灰分、蛋白质、膳食纤维、重金属及农药残留等理化指标、感官指标和微生物限量予以明确说明;对具有生理活性功能的次生代谢物的评价,该标准只将玛咖酰胺列为唯一的检测项,而对总糖、总生物碱、总皂苷、总黄酮等次生代谢物没有明确要求,这可能与目前的技术检测手段不完善有相当大的关系,期待后续进一步完善。

要唱好一首歌曲,先不要急着唱,先对歌词进行认真地熟读。每一首声乐作品,总是表现作者对现实生活的感受,凝聚着作者的强烈感情。歌词中的每一个字都藏着作者的深厚情感。歌唱者必须对歌词进行认真地分析和研究。歌曲的思想感情,虽然是借助于歌词和旋律共同体现,然而要掌握歌曲的具体内容与情感的细微变化,主要还在于对歌词的理解,体验和感受。以达到对歌词内容有深刻的理解,做到“未成曲调先有情”。声乐的情感首先就来源于对歌词的深入体验,只有理解才有感受,有了感受才有感而发,有感而唱,以情动人。

在玛咖提取物方面,目前还没有统一的国家、地方或者行业标准,市场上出现的玛咖提取物几乎都是比例提取物,没有非常明确的成分与含量,这对玛咖产业的发展,尤其是涉及到国际贸易极为不利,希望尽快建立相关标准。李大伟[45]利用对照提取物技术和三级制备色谱分离技术对玛咖提取物中的15种活性成分进行制备分离,利用分离所得对照品对玛咖进行质量控制,建立玛咖主要活性成分的多指标质量控制体系,制定了实验室级别玛咖提取物的质量标准。

4 结语

18F-FDG PET/CT测量食管鳞癌病变长度及预测T、N及G分期的临床价值(王 菲)(5):429

作为功能和保健食品中的热门产品,玛咖在国内种植规模不断扩大,目前主要是通过磨粉或初步浸泡制成保健食品、药酒等,并未对其抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等功效成分进行活性追踪、深入开发,消费方式比较单一,不利于玛咖产业健康发展。对功效成分的活性追踪,了解其作用机制,确定临床疗效,丰富玛咖产品门类,将是今后的发展重点。

受生长环境、气候、品种等多因素的影响,玛咖中各种成分的含量差异巨大,因此,建议针对不同的活性成分,尽快在全国建立统一的检测标准、评价标准,从源头上保证植物提取物的纯正和质量,加强具有特殊功能的植物提取物质量标准的研究,尽快建立提取物相关标准,这样才利于植物提取物行业的快速健康发展,才能使其不断走向现代化和国际化。

另外,目前市场主要针对玛咖根茎部位的利用和开发,致使每年数以百吨计的“下脚料”被废弃,但“下脚料”却含有丰富的营养,故应加大对其有效成分的分离和纯化,实现玛咖资源最大化利用。

三是农民水费支出减少,促进了农业增产增收。水价改革实施后,农户的平均水费支出由30.58元/亩降至20.7元/亩。当阳市半月燎原项目区实施前,水费亩支出51元,占亩均纯收益的9%。项目实施后,水费亩支出28.5元,占亩均纯收益的3.5%。

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高续春,代宏哲,徐伟洲,张少勇,樊君,尉亚辉
《化学与生物工程》 2018年第05期
《化学与生物工程》2018年第05期文献

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