先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HD），亦称肠无神经节细胞症（aganglionosis），是小儿较为常见的一种先天性消化道畸形，其发病机制为病变肠管神经节的完全缺如或减少，可能与肠神经嵴干细胞（enteric neural crest stem cells ，ENCSCs）迁移、增殖、分化的异常有关。目前国内外学者已从鼠、人体成功分离并培育出 ENCSCs［1－5］，但这种细胞是否适合移植治疗HD尚处于实验阶段，这就需要我们寻找一种操作简单、移植后容易观察和研究的动物模型。所以，本实验通过苯扎氯胺（BAC）处理新生大鼠直肠，建立无神经节细胞性巨结肠动物模型，为ENCSCs移植治疗巨结肠病建立可用的动物模型。

材料与方法

一、无神经节细胞动物模型的建立

选用第三军医大学大坪医院医学实验动物中心提供的产后1周龄SD大鼠乳鼠16窝，每窝按体重排序编号，用随机数字表法将每窝乳鼠分为两组：BAC直肠灌注组，生理盐水灌注组，每组各64只。产后1周后，采用自制的灌注针头连接微量注射器，插入乳鼠直肠内，每5 min推注1%的BAC（德国 Sigma-Aldrich 公司）0．05 mL，持续30 min，对照组更换1%的BAC为等量的生理盐水。

二、观察实验大鼠的生活习性改变及直肠大体形态的改变

取处理后的16窝乳鼠分别于2、4、6、8周随机取4窝，分别记录各组大鼠的饮食、活动、腹部情况及排便情况，采用颈椎脱臼法处死后解剖取材，拍照记录直肠的大体形态变化。

三、HE观察并计数神经节细胞数量

将实验大鼠直肠完整取出后，4%甲醛固定一夜，行石蜡包埋、切片，行苏木素／伊红（HE）染色，之后每张切片随即挑取6个视野计数神经节细胞数量并记录。

四、HuD蛋白免疫荧光（IF）观察肠神经节细胞

石蜡切片进行脱蜡、梯度酒精处理后，行微波抗原修复，10%正常山羊血清封闭，滴加小鼠抗鼠HuD一抗1∶50（美国Santa Cruz公司），4℃冰箱孵育过夜、复温，滴加FITC标记的山羊抗小鼠二抗1 ∶25（美国 Proteintech Group公司），37℃下避光孵育1 h，滴加 0．1%的 DAPI溶液，室温孵育 2～3 min，每步之间用PBS冲洗3 min，重复 3次，最后用抗荧光淬灭封片剂（上海碧云天生物技术有限公司）封片，待自然干燥后用荧光显微镜观察并拍照。

五、qRT-PCR检测直肠 GDNF、nNOSmRNA的表达

术后2周、4周，实验组与对照组直肠均可见肌间及黏膜下神经丛，神经节细胞体积较大，胞核色浅呈圆形，核仁明显，大小、形状无明显区别，2周、4周实验组与对照组神经节数量比较无明显差别（P＞0．05）；术后6周，实验组可见肌间神经节稀疏变细，神经节细胞体积变小，核固缩，神经节数量为3，而对照组为6，差异有统计学意义（z＝ －5．82，P ＜0．01）；至术后8周，实验组肌间、黏膜下神经丛完全消失，镜下未见明显神经节结构，见图2。

六、统计学处理

共处理16窝乳鼠128只，BAC实验组与生理盐水对照组分别64只，其中BAC实验组中1只因术中麻醉过量死亡，余均存活，生理盐水对照组无死亡。术后实验组与对照组大鼠均有不同程度的腹泻，以术后48 h内最明显，1周后，腹泻逐渐消失，至2周时，已无腹泻症状；术后6周时，实验组大鼠出现轻微腹胀，排便减少；术后8周，实验组大鼠腹胀加重，食欲下降，排便进一步减少，出现精神萎靡，对照组无上述表现。术后2周、4周实验组大鼠直肠无明显狭窄，肠管无明显扩张，与对照组比较无明显变化；术后6周实验组大鼠可见直肠较对照组稍狭窄，粪便通过障碍，而近端肠管尚无明显扩张改变；术后8周可见实验组大鼠结肠较对照组明显积气扩张，直肠狭窄明显，粪便通过狭窄段困难，近端肠管明显积气扩张，对照组无明显异常变化，见图1。

八是要学习和实践马克思主义关于世界历史的思想。学习这一思想的现实意义在于增强积极开展大国外交、积极参与全球治理的自觉性，增强对马克思主义世界历史理论的自信。

结 果

一、术后大鼠的存活情况及直肠形态学变化

运用SPSS19．0统计软件进行统计学分析，服从正态分布的计量资料以（x±s）表示，采用两独立样本资料t检验；不服从正态分布的计量资料以中位数（M）和四分卫间距（IQR）表示，采用两独立样本秩和检验。检验水准为α＝0．05，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2、4、6、8 周实验组与对照组 GDNF mRNA 和nNOS mRNA的表达量见表1。术后第6周和第8周实验组GDNF mRNA的表达与对照组存在差异，经统计学分析差异有意义（P＜0．001）；术后第6周和第8周nNOS mRNA的表达实验组与对照组存在差异，经统计学分析差异有意义（P＜0．001）。

  

图1 术后2、4、6、8周对照组与实验组处理段直肠。A为2周实验组；B为2周对照组；C为4周实验组；D为4周对照组；E为6周对照组；F为6周对照组；G为8周对照组；H为8周对照组。Fig．1 Rectums of control and experimental groups at Weeks 2，4，6 ＆ 8 post-operation

二、HE染色观察神经节细胞

参照试剂盒说明书进行操作（TaKaRa公司RNAiso Reagent），提取总 RNA，用 NanodroP1000 核酸蛋白测量仪检测RNA的纯度，确保提取的RNA在A260／A280吸光度比值在1．8～2．1之间，之后参照试剂盒说明书（TaKaRa公司 Prime ScriPt RT reagent Kit）进行逆转录反应，取逆转录得到的cDNA行 qRT-PCR，反应体系为25 μL，反应条件为预变性95℃ 30 s，PCR 反应 95℃ 5 s，60℃ 30 s，循环40次，测溶解曲线50℃ ～95℃ 30 s，循环81次，得到的数据采用2－△△ct法进行统计学分析。

  

图2 术后2、4、6、8周实验组及对照组HE染色结果（HE×200）。A为对照组组；B为术后2周实验组；C为术后4周实验组；D为术后6周实验组；E为术后8周实验组Fig．2 HE stain of rectums in control and experimental group at Weeks 2，4，6 ＆ 8 post-operation （HE， ×200）

三、HuD蛋白免疫荧光（IF）染色观察肠神经节细胞

HuD蛋白是一种RNA结合蛋白，可以清晰的显示出肠道肌间神经丛的神经节细胞，它与其他标记物不同，HuD多在核内表达，胞质基本无表达，神经纤维基本不着色，因此在行免疫荧光染色时，可以有效地分辨出神经元的数量、大小，排除了神经纤维的干扰［11］。本研究显示6周时实验组HuD的肌间神经丛变小、形态各异，至8周时已无法看到HuD表达。可以看出，直肠灌注BAC可以导致大鼠直肠神经节细胞完全缺如，达到与临床上HD相似的效果。

四、qRT-PCR检测GDNF、nNOS的表达

切片时长的大小对预测结果有很大的影响.本次实验进行了两轮,预测结果均为单节点对间的链路状态,第一轮实验验证切片时长获取方法的合理性,设定不同的切片时长T1、T2、T3与式(1)计算所得的最优时长TR进行对比,这四种时长分别为180s、240s、480s和320s.第二轮实验则与文献[21]中切片效果作对比,TS1、TS2、TS3均为该文献中使用的切片时长,分别为300s、600s和1800s,实验结果如图10、11所示.

Of the overweight outpatients, the rate of undernutrition was 2%, while it was 8.9% in overweight inpatients. The rate of overweight outpatients at risk of malnutrition was 28.3%, but this rate reached 33.3% in those hospitalized.

  

图3 灌注后实验组及对照组HuD免疫荧光化学染色结果（IF×200）。A为对照组；B为术后2周实验组；C为术后4周实验组；D为术后6周实验组；E为术后8周实验组Fig．3 Immunofluorescent stain of HuD protein in rectums of control and experimental groups post-injection （IF， ×200）

 

表1 实验组和对照组GDNF和nNOS mRNA的表达（x ± s）Table 1 Expressions of GDNF and nNOS mRNA in experimental and control groups（x ± s）

  

变量实验组对照组t值P值G D N F第2周0．9 9 ±0．4 8 1．0 9 ±0．4 7－0．4 4 6 0．6 6 3第4周0．6 9 ±0．4 3 1．0 8 ±0．4 3－1．7 4 8 0．1 0 4第6周0．0 6 ±0．0 3 1．0 5 ±0．3 2－8．6 4 4＜0．0 0 1第8周0．3 9 ±0．2 4 1．0 2 ±0．2 2－5．4 4 3＜0．0 0 1 n N O S第2周0．6 9 ±0．3 1 1．0 2 ±0．4 6－1．7 2 9 0．1 0 6第4周1．4 0 ±0．9 3 1．0 8 ±0．4 4 0．8 4 7 0．4 2 1第6周0．5 4 ±0．3 3 1．1 4 ±0．5 0－2．8 4 5 0．0 1 3第8周0．3 ±0．2 4 1．0 3 ±0．2 6－4．9 2 8＜0．0 0 1

讨 论

近年来，国内外学者已从胚胎和成体组织成功提取出肠神经嵴干细胞（ENCSCs），并在体外培育成神经球（NLBs），且该NBLs可分化为神经元和神经胶质细胞，这为移植替代治疗HD提供了可靠的供体［1－5］。但早期的HD移植模型多为体外培育的肠管组织和基因修饰的动物模型［6］，体外培养组织移植存在局限性，而基因修饰模型虽然能造成肠道神经节的缺如，但实验动物大多因基因的缺陷出生不久后死亡，二者均较难观察成体肠管内移植后的情况［7］。 1978 年 Sato A［8］第一次报道使用 BAC 破坏肠道神经元，成功建立HD大鼠模型。此后，国内外学者也成功建立了空肠、回肠、结肠无神经节细胞症的动物模型［9，10］。但以上几种模型均需行开腹关腹手术，如需行移植实验，还需要二次手术，模型死亡率高，故本实验通过直肠灌注BAC法，避免了开腹关腹的风险，明显提高了术后存活率，且采用乳鼠作为实验对象，更加符合小儿HD的特点，这便成为了一种更加合适的移植模型。

对照组2、4、6、8 周及实验组 2、4 周，荧光显微镜下均可见肌间神经丛表达明亮的黄绿色荧光，神经节细胞胞核染色明显，胞质染色较淡或无着色，神经纤维未着色，黏膜下神经节区域染色不清，无法辨别，各组间神经丛染色无明显区别；实验组在6周后，神经丛体积变小，形态变差，神经节细胞数目减少；8周后，实验组未见到阳性黄绿色荧光表达，见图3。

GDNF是一种分泌蛋白，属于转化生长因子β超家族，通过与GDNF家族受体α1结合形成复合物，可以结合并激活跨膜受体酪氨酸激酶（RET），促进胚胎期肠ENCSCs的迁移、增殖、分化、存活而形成正常的ENS，胚胎期GDNF的缺乏将导致ENS发育缺陷，引起 HD 的发病［12，13］。 目前国内外学者在对HD患儿病变肠管GDNF表达的研究中发现患儿病变肠管的表达量较正常组均降低，这与我们的动物实验结果一致［14，15］。 值得注意的是，GDNF 在8周实验组较6周实验组明显增高，原因不明，查阅相关文献认为是GDNF在成体神经元的轴突生长、细胞存活及神经损伤再修复上起到重要的作用，BAC处理后的肠管在一段时间后，肠神经系统存在自我修复情况，但这种自我修复的机制目前尚不清楚［16－20］。

nNOS是肠道合成释放抑制性神经递质NO的关键酶，当缺乏这种关键酶时，NO的合成释放将会减少，可导致在平滑肌水平缺乏一个抑制性松弛信号，使NO缺乏段肠管紧张度增加。肠道内NO由肌间神经节通过激活的nNOS合成后释放，肠管肌间神经节可以检测到nNOS的表达，先天性巨结肠患者病变段的nNOS mRNA表达是减少的甚至不表达，我们的结果也显示了nNOS mRNA在实验组的表达降低，这也进一步表明BAC处理后的肠管能够建立与临床HD类似的无神经节细胞动物模型［21，22］。但是我们所制作的这种无神经节细胞大鼠模型，尚不能完全代替临床上的HD，相对而言，基因敲除动物模型可以达到相对完善的HD模型，但其制作难度及成本高、实验条件苛刻，不能普及，而我们所建立的HD模型存活率高，存活时间长，饲养方便，更适合研究无神经节细胞性巨结肠病的病理过程、发病机制和治疗措施。

柳含烟停下了，但白雪行动起来，她将落在地上的衣服堆在一起，柳含烟似乎知道她要做什么，按住急剧起伏的酥胸，向石屏上的宝蓝色罩袍示意，可白雪摇头，她吃力地将井水一桶又一桶摇起，一边不断的踩踏衣物，一边将桶里的水浇在衣服上，直到满意了，又将污垢的靴子鼓捣起来。看她如此柳含烟好几次欲言又止。

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