黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是动物摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料后经肝脏代谢的产物，存在于动物的乳、肝脏、肌肉、蛋以及尿液中，以乳最为常见[1]。黄曲霉毒素M1具有与黄曲霉毒素B1相似的结构和毒性，其理化性质很稳定，在牛奶经过巴氏消毒后，几乎不被破坏。1993年，世界卫生组织国际癌症研究机构 （WHO/IARC）将黄曲霉毒素M1列为2B类致癌物质。近年来，世界各个国家和组织纷纷制定了乳中黄曲霉毒素M1的限量标准，中国、美国、日本、韩国及国际食品法典委员会 （CAC）规定乳及乳制品中黄曲霉毒素M1含量不得超过0.5 μg/kg，而欧盟则采用更严格的标准，生乳中黄曲霉毒素M1限量为0.05 μg/kg，婴幼儿配方乳粉中为0.025 μg/kg。

目前对黄曲霉毒素M1的检测方法主要有薄层色谱法、液相色谱荧光法[2～6]、液相色谱－串联质谱法[7～10]和酶联免疫法[11]等，相对于其他几种检测方法，液相色谱－串联质谱法具有灵敏度高，选择性好等优点，其缺点是容易受到基质效应的影响。消除基质效应的方法有优化前处理净化方法、空白基质匹配校正标准法、同位素内标法等[12～13]。通过优化前处理净化方法来减少基质效应的同时，目标物也容易受到损失；空白基质匹配校正标准法则需要制备多份空白样品基质溶液，费时费力。同位素内标和目标物具有相似的化学性质和色谱行为，可以同时补偿样品前处理的损失和离子化时的基质效应[14]，因此本文利用稳定同位素13C标记的黄曲霉毒素M1做内标，选取弗罗里硅土柱进行样品前处理，研究建立牛奶中黄曲霉毒素M1的液相色谱串联质谱检测方法。

汉麻籽油不易储存，稳定性差。笔者对冷榨和热榨汉麻籽油在不同储存环境下的理化性质进行了研究，重点探究其外观和紫外-可见吸收光谱及油脂中脂肪酸的气相色谱-质谱图（GC-MS），通过对不同环境下油脂储存理化性质的比较，对油脂的储存使用提供一定的理论指导。

一、材料与方法

（一）材料与试剂　黄曲霉毒素M1标准品溶液 （质量浓度10 mg/L，美国o2si公司）；13C17－黄曲霉毒素M1（13C17－AFM1）标准品溶液 （质量浓度0.5 mg/L，挪威Chiron公司）；甲醇、丙酮、甲酸（HPLC级，美国Merck公司）；甲酸铵 （色谱纯，瑞士Fluka公司）；实验用水为超纯水 （18.0 MΩ·cm）；50 mL聚苯乙烯离心管 （美国BD公司）；弗罗里硅土柱 （3 mL/500 mg，60～140目），购于美国Phenomenex公司。

（二）仪器与设备　AB Sciex 5500 QTRAP液相色谱－三重四极杆串联质谱仪 （美国应用生物系统公司）； MTN-2800W氮吹仪 （天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；旋涡混合器 （德国IKA公司）。

图1中的创业知识主要指与大学生创业有关的大学生创办企业时政府在工商、税务、贷款、扶持、场地、资金等方面的政策，各地对大学生创业都有一定的支持与优惠。自2010年起教育部发布《教育部关于大力推进高等学校创新创业教育和大学生自主创业工作的意见》后，这种优惠与扶持的力度更大了，特别是在当今国家大力畅导创新创业的导向下，国家及各级政府相继出台了支持大学生创新创业的支持政策，包括资金、场地、人才、技术等。在北京、上海、成都、青岛等全国众多城市都出台了相应大学生创业支持政策；法律知识指涉及企业创立与运作的基本法律、公司企业法律、劳动法律、税法等。

（三）方法

4.质谱条件：电喷雾正离子源 （ESI+）；检测模式为多反应监测模式 （MRM）；电喷雾电压为4 500 V；离子源温度为450℃；其他质谱参数见表1。

根据前期实验数据，含有黄曲霉毒素B族和G族的甲醇－水 （体积比为8∶2）溶液可以直接上弗罗里硅土固相萃取柱并获得良好的回收率[19]。本实验首先考察了相同实验条件下黄曲霉毒素M1在弗罗里硅土柱上的回收率。配制25 mL黄曲霉毒素M1质量浓度为1 μg/L的甲醇－水 （体积比为8∶2）溶液，上弗罗里硅土柱，弃去流出液，用5 mL的丙酮－水－甲酸溶液 （体积比为96∶3.5∶0.5）洗脱吸附在固相萃取柱上的目标物，收集于玻璃离心管中，在50℃水浴温度下氮吹至干，用初始流动相溶解残渣并定容至1 mL；结果显示，黄曲霉毒素M1在弗罗里硅土柱上的回收率为84%，满足实验需求。

[2] 张建国.平顶山矿区煤与瓦斯突出事故分析及防治技术[J].煤炭科学技术,2018,46(10):9-15.

1.标准溶液的配制。用移液器准确移取50 μL的黄曲霉毒素M1标准溶液 （10 mg/L），置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为10 μg/L的标准工作溶液；准确移取100 μL的13C17－黄曲霉毒素M1标准溶液 （0.5 mg/L）于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为10 μg/L的标准工作溶液。

儿童肥胖已成为全球突出的公共卫生问题。目前，中国儿童肥胖发展速度快于欧美发达国家[1]。且呈现城市高于农村的特点，尤其是在经济发展快的大城市，儿童肥胖已成为影响儿童健康的主要公共卫生问题[2]。儿童时期肥胖不但增加多种疾病的发病风险、影响心理健康和学习能力，80%肥胖儿童还可延续至成人肥胖，与成年期许多慢性疾病如高血压、高血脂症、糖尿病、动脉粥样硬化性心脑血管疾病及成人期癌症有非常密切的关系[3-5]。预防和干预儿童肥胖的流行已刻不容缓。

 

表1　黄曲霉毒素M1及其内标的质谱参数

  

*为定量离子。

 

化合物　母离子（m/z）30 30 13C17－AFM1　346　317*288碰撞能量（eV）AFM1　329　273*259子离子（m/z）去簇电压（V）53 53 53 53 30 30

二、结果与讨论

液体牛奶含水量普遍在85%左右，因此实验考虑直接往液体牛奶中添加一定体积的甲醇，使乳蛋白沉淀后上清液中甲醇与水的体积比为4∶1。经理论计算，当移取的牛奶样品量为5 g时，加入17 mL甲醇可满足要求。实验同时考察了该比例时甲醇对牛奶的沉淀效果，移取5 g的牛奶样品至50 mL的离心管中，加入17 mL甲醇，涡旋后在转速3 500 r/min下离心10 min，结果表明，甲醇体积为17 mL时牛奶的沉淀效果良好。在上述前处理条件下，样品提取和固相萃取柱净化过程具有良好的匹配性。

3.液相色谱条件：Phenomenex Kinetex色谱柱（100 mm×2.1 mm， 2.6 μm）。 流动相：A 为 5 mmol/L甲酸铵水溶液，B为5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；梯度洗脱程序为0～0.5 min，90%A；0.5～6.0 min， 90%A～5%A； 6.0～8.2 min， 5%A；8.2～8.7 min，5%A～90%A； 8.7～10.0 min， 90%A。流速为0.7 mL/min。柱温为35℃。进样量为5 μL。

  

图1　黄曲霉毒素M1（a)及其内标 （b）的MRM色谱图

 

a－黄曲霉毒素M1，质量浓度为0.5 μg/L；b－13C17－黄曲霉毒素M1标准品溶液，质量浓度为0.5 μg/L

（三）线性范围与定量限　用初始流动相配制黄曲霉毒素M1质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/L的溶剂标准品，各含 0.5 μg/L同位素内标，在建立的色谱－质谱条件下进行测定。采用加权最小二乘法建立标准曲线，权重选择1/x。

2.样品前处理：准确移取5.00 g牛奶样品至50 mL离心管中，加入50 μL13C17－黄曲霉毒素M1标准工作溶液，涡旋1 min后静置1 h。加入17 mL甲醇，涡旋2 min，转速为3 500 r/min下离心10 min。移取上清液过弗罗里硅土柱，流速为3～6 mL/min，然后2.5 mL异丙醇淋洗，弃去淋洗液，用5 mL的丙酮－水－甲酸溶液 （体积比为96∶3.5∶0.5）洗脱吸附在固相萃取柱上的目标物，收集在15 mL的带刻度玻璃离心管中，50℃水浴温度下氮吹至干；1 mL甲醇溶解残渣，涡旋助溶，溶液过0.22 μm的尼龙滤膜至进样小瓶，待上机分析。

中南大学在2016级、2017级冶金、工管、能器、机械、临床等非计算机专业约840名学生的“数据库技术与应用”课程进行了连续两年交叉融合的教学模式的实践，课程共48课时，为期12周，获得了比对效果较好的应用数据。

（一）色谱质谱条件的建立　黄曲霉毒素M1为中等极性的化合物，在普通反相C18柱上可得到较好的保留。实验选取100 mm×2.1 mm，2.6 μm Kinetex色谱柱，甲酸铵浓度为5 mmol/L的水溶液和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，调整流动相比例，黄曲霉毒素M1的保留时间为4.1 min。根据欧盟2002/657/EC指令规定，在应用低分辨液相色谱－质谱联用仪对目标分析物进行确证时至少需要4分，即需要1个母离子 （1分）和由该母离子碎裂后得到的两个子离子 （各1.5分）。在电喷雾正离子模式下，以[M+H]+为母离子，选择经碰撞后丰度最高的两个子离子作为定量和定性离子，同时对质谱条件进行了优化，优化后的质谱参数列于表1。在上述色谱－质谱条件下，得到黄曲霉毒素M1及其内标的色谱图 （见图1）。

（二）前处理条件的选择与优化　为满足牛奶中痕量黄曲霉毒素M1的分析，通常都需要先沉淀蛋白再过固相萃取柱进行浓缩净化。因甲醇对牛奶蛋白具有一定的沉淀作用，且对黄曲霉毒素具有较好的提取效果，常被用作提取溶剂[15]。弗罗里硅土曾作为微柱的吸附材料用于黄曲霉毒素的快速测定[16～17]，Sobolev[18]的实验证实，弗罗里硅土吸附剂可以从极性的甲醇水溶液中萃取黄曲霉毒素，因此实验选择甲醇作为提取溶剂，弗罗里硅土柱作为净化柱。

通过计算，得到黄曲霉毒素M1与内标13C17－黄曲霉毒素M1的峰面积比值对质量浓度的线性方程y＝11x+11，线性相关系数 （r2）为0.999 5。综合考虑样品量和样品溶液定容体积，按照S/N≥3和S/N≥10设定方法的检测限 （LOD）和定量限（LOQ） 分别为 0.005 μg/kg 和 0.015 μg/kg。

社区矫正经国外许多国家的长期实践,已经取得了良好的效果。在我国，社区矫正属于新兴的刑罚执行措施，其发展任重而道远。健全和完善的社区矫正制度是提高罪犯改造质量的有效途径，是适应国际刑罚轻缓化的需要，有助于促进我国社会和谐、持续、健康的发展，推动法治中国的建设。

（四）回收率和精密度　通过对牛奶基质的筛选，在一个污染水平较低的牛奶样品上进行1倍、2倍和10倍定量限3个浓度水平的添加回收实验，每个水平做6个平行，得到的回收率和相对标准偏差 （RSD）如表2所示。黄曲霉毒素M1平均回收率＞90%，RSD介于4.7%至10.6%之间，符合GB/T 27404－2008对回收率和精密度的要求[20]。

 

表2　黄曲霉毒素M1的添加回收率和相对标准偏差 （n=6）

  

注：回收率＝（测量值－背景值）/添加水平×100%。

 

化合物　背景值（μg/kg）添加水平（μg/kg）测量值（μg/kg）回收率（%）RSD（%）AFM1　0.008 0.015 0.030 0.150 0.022 0.036 0.153 94.4 96.1 97.2 10.6 4.7 5.3

（五）实际样品测定　采用本文所建方法对市场上购买的10个牛奶样品进行了检测，其中7个样品检测值高于本方法定量限0.015 μg/kg，但低于我国法规限量0.5 μg/kg，剩下3个样品的检测值低于本方法定量限。

三、结论

样品经甲醇－水溶液 （液体奶中加入一定比例的甲醇）提取后，直接过弗罗里硅土柱净化，前处理步骤简单快速，有效避免了使用免疫亲和柱时的堵柱问题；同时由于实验使用稳定同位素13C标记的黄曲霉毒素M1做内标，有效补偿了样品处理中的损失和离子化时的基质效应，提高了方法的准确度。本文基于液相色谱串联质谱技术建立的牛奶中黄曲霉毒素M1检测方法，灵敏度高、定量限低于法规限量要求，完全适合液体奶中黄曲霉毒素M1的日常监控。

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