梨是我国第三大水果，2016年产量为1 870万t，占我国园林水果总产量的10.3%[1]，在水果市场具有无可替代的重要地位。黑星病、黑斑病、轮纹病是危害我国梨产业的主要病害。目前我国主要使用戊唑醇、甲基硫菌灵、多菌灵、苯醚甲环唑等杀菌剂进行防治[2～3]。对我国梨进行农药残留监测与风险评估发现，因在生产中使用频率高，以上几种常用农药成为我国梨果实中残留最多的杀菌剂种类[4]。近年来，鉴于生产上时有反映以上传统杀菌剂防治效果下降甚至失效的现象[5]，且随着有关其生殖毒性和内分泌干扰毒性报道越来越多[6～9]，有些国家要求在农产品中慎用这些杀菌剂[10]，筛选有效替代农药成为今后该领域的一个重点工作。腈苯唑是一种三唑类广谱杀菌剂，在果树生产中主要用于防治黑星病、褐腐病、叶斑病等，是一种发展前景良好的新型替代农药[11～13]。然而，对腈苯唑在梨中的消解动态变化规律及其膳食摄入风险评估尚未见报道。开展梨中腈苯唑高效定量检测方法、消解动态和风险评估研究，对于监测梨中腈苯唑安全，指导梨中腈苯唑的登记和引导科学消费具有重要的参考意义。

一、材料与方法

（一）主要仪器　UPLC－MS/MS XEVO TQ型超高效液相色谱－串联质谱仪 （美国 Waters公司）；旋转蒸发仪 （瑞士Buchi公司）；立式大容量高速离心机 （日本Hitachi公司）；Milli－Q全自动超纯水制水机 （美国Millipore公司）；电子分析天平 （瑞典梅特勒托利多公司）。

但是随着与菲莉斯恋爱关系的推进，卡夫卡对于婚姻带来的伦理关系和肉体关系的恐惧逐渐增加。在日记中他剖析自己“恐惧结合，恐惧失落于对方”[13]117-137，用他自己的说法，除写作之外，他几乎恐惧一切。

（二）试剂与材料　99.2%腈苯唑 （fenbuconazole）标准品，规格为10 mg，德国Dr.Ehrenstorfer公司。根据需要用乙腈配成合适的标准工作溶液，于－20℃冰箱中保存备用。24%腈苯唑悬浮剂，美国陶氏益农公司，用于田间消解动态试验。甲醇、乙腈、乙酸铵 （UPLC级，美国Thermo Fisher Scientific公司）；乙酸 （UPLC级，美国J.T.Baker公司）；C18吸附剂 （30～40 μm，上海康标化学品有限公司）；无水硫酸镁 （分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；氯化钠 （优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），140℃烘干4～5 h；试验用水为超纯水 （经Milli－Q超纯水机制备）。

按照教育部的要求，班主任选聘的一般都是政治强、业务精、纪律严、作风正的优秀中青年教师。这部分教师是学科发展的未来之星，他们身上的正能量会激发大学生对专业的热爱并投身科研。班主任在学科领域的专长既可以为大学生专业学习答疑解惑，又会成为大学生比学赶超的对象［2］，也会带动整个班级形成专业自信的氛围，使学生明确专业发展目标，避免盲目学习。

（六）计算公式　腈苯唑消解反应动力学方程按公式（1）计算，降解半衰期按公式 （2）计算[14]，腈苯唑在梨果实中的急性膳食风险按公式 （3）计算[15～16]。

（四）样品提取和净化　将采回的梨果实按四分法缩分，切碎、混匀，用组织捣碎机制成匀浆。准确称取10 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，充分摇匀2 min，再加入4 g无水硫酸镁和2 g氯化钠，充分摇匀2 min，置高速离心机中10 000 r/min离心3 min，吸取5 mL上清液加入装有0.5 g C18+无水MgSO4（1+3）混合剂的离心管中进行净化，充分混匀2 min，于10 000 r/min离心3 min后取上清液，经0.22 μm尼龙滤膜过滤，滤液供UPLC－MS/MS分析。

式 （2）中，T1/2为降解半衰期，K为消解系数。

（三）梨中腈苯唑急性膳食摄入风险评估　根据FAO/WHO农药残留联席会议 （JMPR）评估报告对腈苯唑ARfD值的规定，结合我国不同人群的平均体重数据、大份餐数据以及本研究测得的不同时期梨中腈苯唑残留数据，对我国不同人群通过食用梨摄入不同残留腈苯唑的急性风险进行评估，结果如表4所示。由表4可见，在梨生长期内以144 mg/kg高剂量施用腈苯唑农药3次，不同采样间隔的梨果实内腈苯唑残留浓度对不同人群的急性膳食风险均在可接受范围内。施药后2 h，2～6岁儿童的膳食风险最高，急性风险为19.00%，之后逐渐降低；在第2次和第3次补施腈苯唑后，风险水平有所增加，但均未超出可接受范围。在第45 d，不同人群的急性膳食风险水平均远低于100%，风险极低。

党的十八大以来，以习近平总书记为核心的党中央，把脱贫攻坚摆到了治国理政突出位置，打响了一场史无前例的脱贫攻坚战。江西省立足实际，坚持把扶贫开发纳入经济社会发展总体规划，作为民生工程和新农村建设重要任务，真抓实干，在深入推进精准扶贫精准脱贫各项任务中，通过党建+扶贫、产业精准扶贫、移民扶贫等创新模式，因地制宜推出一系列扶贫的新办法、新路子，帮助贫困地区群众摆脱贫困，走上一条脱贫致富的小康之路，成为老区扶贫新样板。

2.质谱条件。电喷雾离子源 （ESI）。扫描方式为正离子模式。检测方式为MRM （多反应监测）。离子源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，流速分别为650 L/h和50 L/h。碰撞气为高纯氩气，流速为0.14 mL/min。优化后的质谱参数见表1，腈苯唑的提取离子色谱图如图1所示。

刘丽芳心情复杂地按响了1502号房的门铃。门铃声格外清晰。欧阳锋坐在那没动。铃响第三遍的时候吕凌子起身走到防盗门边，从猫眼里见到了一位年龄与自己不相上下、身材也与自己差不多的陌生女人。吕凌子尚未将门完全拉开，刘丽芳已经闪进客厅。刘丽芳的突然到来让欧阳锋感到坐立不安，无所适从，厚嘴唇动了好几下，欲言又止。

3.标准曲线的绘制。使用空白梨样品提取溶液， 配制浓度为 10、 20、 50、 100、 200 μg/kg的基质匹配标准工作溶液，在上述液相色谱/质谱条件下测定，绘制标准工作曲线，以仪器响应峰面积对目标药剂的各浓度进行线性回归。梨基质匹配标样线性回归方程为y＝256.4x+960.7，相关系数为0.999 9，在10～200 μg/kg质量浓度范围内线性关系良好。

1.色谱条件。色谱柱：HSS T3柱 （100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1%乙酸和4 mmol/L乙酸铵的水溶液；柱温40℃；进样体积5 μL；流速为 0.4 mL/min。梯度洗脱程序：0～2 min，10%A；2～4 min，90%A； 4～5.5 min， 10%A。

 

表1　多反应检测模式下的质谱参数

  

注：*为定量离子。

 

农药名称子离子2/碰撞能量（eV）腈苯唑　2.49　337.4　32　125.1*/30　70.0/20保留时间（min）母离子锥孔电压（V）子离子1/碰撞能量（eV）

  

图1　腈苯唑农药的提取离子色谱图

（三）田间试验设计　分别于2017年7－8月和2017年7－9月在河北省和辽宁省开展腈苯唑在梨中消解动态试验，选择代表性梨生产园作为试验地，按农药残留试验准则[14]要求设计试验小区，每个小区面积15 m2，重复3次，随机排列，处理间设保护行。梨果实发育至一半大小时施药，施药剂量为144 mg/kg，以喷施清水为对照，分别于施药后 2 h和 1、3、7、 14、21、30、45 d随机采样，每个重复不少于3 kg，装入聚乙烯袋后放入加冰袋的保温箱运回实验室进行检测。另在辽宁试验点设置田间试验处理小区用于风险评估和计算，即在消解动态试验基础上，于第一次喷药后14 d和28 d各增施1次，3次施药分别距采收期为58、44和30 d，采样时间与消解动态试验同步进行。

 

式 （1）中，CT为T时刻腈苯唑的残留浓度，C0为施药后腈苯唑的初始浓度，K为消解系数。

2.1两组产妇产程时间比较,与对照组相比,观察组第一产程及第二产程时间均明显缩短,组间差异有统计学意义(P<0.05),第三产程组间比较无明显差异(P>0.05)。见表1。

式 （3）中，%ARfD表示农药的急性膳食摄入风险，HR表示最高残留量 （mg/kg），此处为施药后动态采集分别测得的残留浓度。U表示单果重（kg）， 梨为 0.255 kg[17]。 LP 表示大份餐 （kg）， 1～6岁儿童为0.418 5 kg，其他人群为0.685 kg[17]。v表示个体之间的变异因子，梨为3[17]。bw为各年龄段人群的平均体重 （kg）[18]。ARfD表示急性参考剂量 （mg/kg·bw）， 腈苯唑的 ARfD 为 0.2 mg/kg·bw[19]。当%ARfD＜100%时，表示风险水平可以接受，当%ARfD＞100%时，表示风险水平超出可接受的范围，%ARfD越小，急性风险越低。

二、结果与分析

（一）方法的准确度、精密度和灵敏度　取空白梨样品，　在2、10、50 μg/kg 3个添加水平下，腈苯唑在梨中平均添加回收率为95.7%～109%，相对标准偏差 （RSD）为3.0%～5.7% （见表2），符合农药残留分析的检测方法要求[14]。根据信噪比S/N=3计算检出限 （LOD），信噪比S/N=10计算定量限　（LOQ），　使用工作站软件中的Peak-to-Peak方式进行计算。结果显示，该方法对梨中腈苯唑的检出限和定量限分别为0.6 μg/kg和2.0 μg/kg。

 

表2　腈苯唑在梨样品中的添加回收率及相对标准偏差　（n=5）

  

添加浓度（μg/kg）相对标准偏差（%）1　2　3　4　5回收率　（%）　平均回收率（%）2.0 10 50 106 98.3 101 119 99.7 88.6 103 99.6 98.1 109 106 99.1 110 102 91.3 109 101 95.7 5.5 3.0 5.7

不同采样间隔的腈苯唑在梨果实中残留量和消解率见表3。由表3可见，梨果实喷施腈苯唑后，前期辽宁试验点的降解速率比河北试验点快，前者降解速率在3～7 d期间降解最快，后者在7～14 d期间降解最快。后期河北试验点降解速率快于辽宁试验点，河北试验点的消解率在30 d时达93.8%，辽宁试验点的消解率在45 d时达93.6%。

（二）腈苯唑在梨果实中的残留消解动态　河北和辽宁两地腈苯唑在梨果实中的原始沉积量分别为0.610 1 mg/kg和0.669 2 mg/kg，腈苯唑在梨果实中的残留量与施药后间隔时间成指数关系，降解动态符合一级动力学方程回归曲线 （见图2）。河北试验点消解动力学方程为 CT＝0.488 9e－0.073T，R2＝0.943 0，半衰期T1/2＝9.5 d；辽宁试验点消解动力学方程为 CT＝0.542 1e－0.057T， R2＝0.981 1， 半衰期 T1/2＝12.2 d。

  

图2　腈苯唑在梨果实中的消解动态曲线

 

A－河北试验点；B－辽宁试验点

 

表3　不同采样时间腈苯唑在梨果实中的残留量

  

采样间隔（d）消解率（%）0　（2h）河北　辽宁残留量（mg/kg）消解率（%）残留量（mg/kg）0.610 1 0.430 5 0.402 8 0.395 2 0.133 6 0.083 7 0.037 7 0.027 5 0 0 1　3　7　1 4 21 30 45 29.4 34.0 35.2 78.1 86.3 93.8 95.5 0.669 2 0.520 6 0.461 5 0.297 0 0.230 9 0.143 5 0.106 7 0.042 7 22.2 31.0 55.6 65.5 78.6 84.1 93.6

（五）检测条件

 

表4　施用腈苯唑不同时间后各人群的急性膳食风险评估

  

施药后时间（d）短期摄入量　（mg/kg bw）　急性膳食风险%ARfD 2～6岁　7～17岁　18～44岁　45～69岁　2～6岁　7～17岁　18～44岁　45～69岁0 （2h）1 3 7 1 4 21 30 45 0.038 0 0.029 6 0.026 2 0.016 9 0.013 1 0.019 3 0.026 3 0.006 6 0.020 6 0.016 0 0.014 2 0.009 1 0.007 1 0.010 5 0.014 2 0.003 6 0.013 5 0.010 5 0.009 3 0.006 0 0.004 7 0.006 9 0.009 3 0.002 4 0.013 2 0.010 3 0.009 1 0.005 8 0.004 5 0.006 7 0.009 1 0.002 3 19.00 14.78 13.10 8.43 6.56 9.66 13.13 3.32 10.29 8.00 7.09 4.56 3.55 5.23 7.11 1.80 6.77 5.26 4.67 3.00 2.33 3.44 4.67 1.18 6.59 5.13 4.54 2.92 2.27 3.35 4.55 1.15

三、结论与讨论

腈苯唑在植物样品中残留量的测定可采用气相色谱－串联质谱法 （GC－MS）和液相色谱－串联质谱 （HPLC－MS/MS）法。王卉等[21]采用气相色谱－质谱法测定了黄瓜中腈苯唑残留量，RSD为96.8%～98.6%，检出限为0.044 mg/kg；谢建军等[22]采用气相色谱串联质谱法对果蔬中腈苯唑等杀菌剂残留进行测定，RSD为99%～108%，检出限为4.2 μg/kg。刘春华等[11]认为， 采用 UPLC－MS/MS方法测定腈苯唑残留，用时更短，准确性和灵敏度更高，测定的腈苯唑检出限可低至0.9 μg/kg。本试验结果表明，采用UPLC－MS/MS方法测定梨中腈苯唑残留，添加回收率在95.7%～109%之间，RSD为3.0%～5.7%，保留时间2.5 min，检出限为0.6 μg/kg，效果良好。

本项目中，根据项目描述及任务分析进行详细的代码设计。首先打开C-Free集成开发平台进行本项目的程序代码设计，点击“工程”菜单的“新建”菜单项，输入项目的工程名称为“ex4_1.cfpg”,然后再点击“文件”菜单的“新建”菜单项，新建一个名称为“ex4_1.c”的C语言源文件，将打印图案的算法代码录入完毕，最后在C-Free平台上调试运行，输出结果。

在我国，目前腈苯唑以24%悬浮剂的剂型在香蕉、桃树和水稻上进行了登记，产品在香蕉树上使用的安全间隔期为42 d，在桃树上使用的安全间隔期为14 d，每个作物周期最多使用次数为3次[2]。通过在两个试验点的梨树上喷施腈苯唑的消解动态试验发现，腈苯唑在梨中的降解行为符合一级动力学方程，在河北和辽宁的消解半衰期分别为9.5 d和12.2 d，半衰期较短，属易降解农药 （T1/2＜30 d）[23]。这将为今后高效、安全、合理地使用腈苯唑防治果树真菌病害提供有益参考。农药的残留量与施药浓度、施药次数有密切的关系，也受当地气候条件的影响[24]，施药后腈苯唑消解速率前期快后期慢，随着时间的延长，残留量逐渐减少，14 d时消解率分别达到65.5%和78.1%，河北试验点在30 d时消解率达93.8%，辽宁试验点在45 d时消解率达93.6%。

我国规定腈苯唑在仁果类水果中的MRL值为0.1 mg/kg[20]，按照高浓度144 mg/kg、次数为3次用药时，45 d采收期前梨果实中腈苯唑残留量均已低于0.1 mg/kg，至成熟采收期残留量将更低，此剂量下使用该农药是安全的。膳食风险评估数据也表明，不同采样间隔的梨果实内腈苯唑残留浓度对不同人群的急性膳食风险均在可接受范围内，在45 d，不同人群的急性膳食风险水平均远低于100%，风险极低。为避免实际生产中随意加大用量和缩短安全间隔期用药现象的发生，应加强及时监测和农药监管。本研究为制定腈苯唑在梨中的合理使用准则以及梨安全生产提供了科学依据。

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