胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是世界第二大死亡相关肿瘤[1-2]。胃癌是一种复杂的遗传性相关性疾病，已经证实了多种基因与胃癌的发生和发展有关，包括致癌基因或抑癌基因[3-4]。尽管最近在手术、放疗和化疗等治疗策略上取得了进展，但胃癌的预后仍然很差[5]。我国目前仍面临着早期胃癌检出率低的严峻挑战。因此，阐明胃癌发生的调控网络，发现新的诊断标志物以及开展新的靶向治疗方法显得至关重要。

溶菌酶(lysozyme)是一种无毒无害的蛋白质，能够选择性的溶解微生物细胞壁，使食品的营养成分得到很好的保存，并具有一定的保健作用。在4±1℃条件下，带鱼段经溶菌酶保鲜液浸渍后，其感官品质、微生物指标和理化指标均优于未经处理的对照组[19]。Enrique等[20]也发现溶菌酶保鲜液对南美白对虾有明显的抗菌作用，能够有效延长南美白对虾的货架期。

长链非编码RNAs(lncRNAs)是长度大于200个核苷酸的但不编码蛋白质的一类RNA[6-9]。全基因组转录组研究(RNA测序、基因芯片与平铺阵列)已发现了数以千计的非编码RNA[10-11]。目前的研究已经证实lncRNAs可以参与许多重要的生物过程，如基因组印记[12]、染色体构象变化及酶活性的的变构调节等[13-14]。另外lncRNA的表达还可以调控细胞分化状态。更重要的是，lncRNA的过度表达或突变或缺失可以导致多种人类疾病的发生[15]。但是，目前对大多数lncRNAs的具体功能仍然是未知的，而且很多lncRNA可能并不存在实际的意义。lncRNA CASC2位于第10号染色体短臂26号位，是由BALDINU等[16]在子宫内膜癌中首次发现。BALDINU等[17]研究发现，CASC2通过可变性剪切形成3个转录变异体，分别为CASC2a、CASC2b和CASC2c。BALDINU等[17]研究还显示，CASC2a在子宫内膜癌中呈低水平表达，通过进一步的研究显示，CASC2a在子宫内膜癌中很可能发挥肿瘤抑制的作用。此外，HE等[6]发现CASC2a/b在非小细胞肺癌中也呈低水平表达，并且CASC2a/b表达水平的高低与非小细胞肺癌病人的预后相关。另外PEI等[18]研究显示，CASC2a/b在膀胱癌病人中表达水平明显降低，而升高CASC2a/b后可以抑制膀胱癌细胞的增殖。但是，目前很少有关于CASC2c对癌症的影响的研究，本实验通过筛选出与胃癌相关的lncRNA CASC2c，探讨CASC2c对胃癌增殖和迁移的影响，以及在胃癌发生发展中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料来源

选取2014年4月-2015年3月在我院确诊的胃癌病人的癌组织及相邻的正常组织标本36例。36例病人中男26例，女10例；年龄42～81岁，平均(60.3±9.8)岁。病人术前均未曾接受过辅助治疗。组织标本RNA提取后立即置于-80 ℃保存。病人同意参与本研究，取样过程在我院伦理委员会监督下进行。

1.2 细胞培养

胃癌细胞SGC-7901及正常人源胃细胞GSE-1细胞均购于美国细胞库(ATCC)。细胞培养液为含体积分数0.10的BI(Biological Industries, Cromwell, CT, USA)胎牛血清的DMEM混合培养液，细胞置于37 ℃，含体积分数0.05的CO2的培养箱中培养。

1.3 载体构建与转染

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)获取人源CASC2c序列。通过聚合酶链式反应(PCR)，采用HotStarTaq DNA聚合酶(QIAGEN, Valencia, CA, USA)扩增CASC2c完整序列。利用DNA连接酶将其插入载体质粒pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的KpnI和XbaI位点之间，以构建过表达载体pcDNA-CASC2c。引物序列如下：上游引物5′-CGGGGTACCCCGGGAGAACAGGATGGCCATGT-3′，下游引物5′-TGCTCT-AGAGCAGCCTTCTCCATGTTGGTCTC-3′。待细胞融合达到80%时使用转染试剂Lipofectamine 3000(Invitrogen公司，美国)转染过表达载体pcDNA-CASC2c。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测转染效率。

我省畜牧业发展以初级养殖为主，在屠宰分割，精细化加工、冷链运输，追溯管理和信息化建设等方面发展不完善，产业链利益联结不紧密，尚未真正实现产、加、销的有机结合，产业融合度低；品牌建设方面，龙头企业的示范带动能力不强，无法有效提升我省畜产品市场竞争力和扩大品牌效应，主要畜产品中除了乳制品加工企业达到42家，位居全国第一位，培育了君乐宝、新希望等品牌之外，生猪、肉牛、肉羊均未形成特色鲜明的地方性品牌。

1.4 RT-qPCR检测胃癌组织及细胞系中CASC2c的表达

RT-qPCR检测结果显示，CASC2c在胃癌组织及相邻的正常胃组织中的相对表达量分别为1 510.371±1 311.034和3 769.740±3 023.203，两者比较差异有显著性(t=3.651，P<0.05)；CASC2c在胃癌细胞SGC-7901和正常胃细胞GSE-1中的相对表达量分别为0.240±0.110和1.170±0.150，两者比较差异有显著性(t=2.366，P<0.05)。

CCK8细胞增殖实验的结果显示，pcDNA-CASC2c诱导CASC2c高表达0、24、48、72及96 h后，实验组SGC-7901细胞在450 nm波长处的吸光度值分别为0.025±0.000，0.640±0.020，0.736±0.028，1.087±0.040，1.325±0.028；对照组SGC-7901细胞在450 nm波长处的吸光度值分别为0.025±0.000，0.733±0.140，0.861±0.030，1.317±0.061，1.536±0.045。与对照组比较，实验组SGC-7901细胞在24、48、72及96 h增殖能力降低，两组比较差异有显著性(t=3.283～18.910，P<0.05)。Transwell实验结果显示，实验组及对照组胃癌细胞SGC-7901穿过小室的数目分别为8.400±3.280和16.400±3.920，两组比较差异具有显著性(t=2.821，P<0.05)。

1.5 采用Western blot检测细胞中各蛋白的表达

我们已经知道，神经元能传递疼痛信号，那我们又是靠什么来区分温柔的抚摸和恶狠狠的拳头的呢？答案是不同种类的神经元。有些神经元只在感受到轻微压力时发出信号，令我们感到愉悦；另一些神经元只对突发的剧烈感受有反应，这就会让我们感到疼痛。那么，问题又来了：为什么手指头划破一个小口子会那么痛？这是因为树突（神经末梢）在人体内的分布是不均匀的，而树突分布最密集的地方就是我们的嘴唇和指尖。

1.6 采用CCK8实验检测细胞增殖能力

取生长状况良好的转染pcDNA-CASC2c的胃癌细胞SGC-7901(实验组)和转染pcDNA3.1的胃癌细胞SGC-7901(对照组)。细胞接种在装有小室的6孔板中，每组设置2个复孔。胃癌细胞SGC-7901悬浮在无血清培养基的上室(约100 000个细胞/孔)(8 μm孔径；BD Biosciences, San Jose, CA, USA)，下室为500 μL含体积分数0.10的胎牛血清的高糖DMEM培养液。24 h后，用棉签轻轻地拭去上室表面的细胞(即未侵入下室的细胞)，侵入下室的细胞采用甲醇固定，然后用结晶紫染色。在倒置显微镜下随机选取5个视野(包括膜的中央和周边)，计数侵入下室的细胞数目。

1.7 采用Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力

取生长状况良好的转染pcDNA-CASC2c的胃癌细胞SGC-7901(实验组)和转染pcDNA3.1的胃癌细胞SGC-7901(对照组)。细胞接种于96孔板(2 000个细胞/孔)，每组设置6个复孔，在37 ℃、含体积分数0.05的 CO2的培养箱中培养。每孔加入新鲜配制的无血清培养基110 μL(含10 μL CCK8检测液)，置于37 ℃培养箱中孵育30 min左右以后，用酶标仪检测细胞在450 nm波长处的吸光度(A)值，分别检测0、24、48、72以及96 h细胞增殖数目变化。

2 结 果

2.1 CASC2c在胃癌组织以及胃癌细胞中的表达比较

采用RNAiso Plus(TaKaRa, Shiga,Japan)分别提取实验组(胃癌组织及胃癌细胞SGC-7901)以及对照组(相邻正常胃组织和正常胃细胞GSE-1)中的总RNA，采用分光光度计检测RNA的浓度以及纯度。利用PrimeScript逆转录酶(TaKaRa, Shiga, Japan)将其逆转录成互补DNA(cDNA)。以cDNA为模板，按照SYBR GREEN EX TaqTM(TaKaRa, Shiga, Japan)说明书要求的反应体系和反应时间在LightCycler 480上进行RT-qPCR，所有实验结果重复3次，结果以2-△△CT计算并进行统计分析。实验以GAPDH作为内参基因。CASC2c上游引物：5′-TTCCTCTCCCCTTTGGACTT-3′，下游引物：5′-TCTGCTTCTGCTGCTGTTGT-3′；GAPDH上游引物：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解实验组SGC-7901细胞(转染pcDNA-CASC2c)和对照组SGC-7901细胞(转染pcDNA3.1)，裂解产物于100 ℃煮10 min，期间每隔3 min剧烈震荡裂解产物以打断DNA。使用BCA法进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳后以0.3 A恒定电流湿法转膜1.5 h，以50 g/L的脱脂牛奶室温封闭1 h。4 ℃一抗温育过夜，TBST洗3次，每次10 min。然后二抗室温孵育1 h。所需抗体为：Anti-p-ERK1/2、Anti-T-ERK1/2、Anti-β-catenin、Anti-GAPDH，均购自于CST(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)公司。蛋白条带使用vilber Lourmat(Eberhardzell, Germany)成像系统进行扫描分析。

2.2 过表达CASC2c对胃癌细胞增殖以及迁移的影响

在考核上，智慧课堂可以利用教室的人脸自动识别技术对学生的面授课出勤情况进行自动统计，PC和移动终端自动记录学生的在线学习痕迹，自动统计其参与在线学习活动的情况，并形成报表，供教师参考。教师不仅可以准确了解学生的出勤情况，还可以通过前后数据比对，了解全部学生的学习态度、能力和习惯，并可就此动态调整课程内容。

（2）使用地质雷达技术，在测区物理环境良好的前提下可以获得清晰的图像异常；但自身也具有一定的局限性，当测试效果不理想时，需要配合其他物探方法共同解决问题。

2.3 过表达CASC2c对p-ERK1/2和β-catenin表达量的影响

Western blot检测结果显示，与对照组相比，实验组p-ERK1/2及β-catenin的表达降低，两组比较差异具有显著性(t=8.538、5.667，P<0.05)；两组T-ERK1/2表达水平比较，两组比较差异无显著意义(t=2.718，P>0.05)。见图1，表1。

表1 不同处理组胃癌细胞中各种蛋白的表达

  

分组p-ERK1/2T-ERK1/2β-catenin对照组0.71±0.220.64±0.040.34±0.02实验组0.29±0.090.57±0.060.20±0.04

  

图1 不同处理组胃癌细胞SGC-7901中各种蛋白的表达

3 讨 论

越来越多的证据表明，lncRNAs在多种生物学过程中发挥着至关重要的作用[19]。相关功能研究表明，某些lncRNAs可以参与人类癌症的发生发展，并发挥癌基因或抑癌基因的作用。例如，MO等[20]研究显示，lncRNA XIST在胃癌组织和细胞系中高表达，并且可以促进癌细胞生长；而YUAN等[21]研究显示，lncRNA DANCR通过阻遏CTNNB1的表达从而起到抑制胃癌生长的作用。然而，由于lncRNA序列和空间结构的复杂性，更多的lncRNAs的功能、作用机制和临床意义尚不完全清楚，有待进一步的深入研究。

lncRNA CASC2通过可变性剪接从而产生CASC2a、CASC2b和CASC2c 3个转录体。以往的研究显示，CASC2a/b参与多种恶性肿瘤的发生以及发展过程，包括胃细胞癌和结直肠癌等，例如CASC2a/b可以作为内源性的RNA竞争性结合miR18a，抑制miR18a的表达，从而抑制结直肠癌细胞的增殖[22]。虽然CASC2c与CASC2a/b序列之间存在较大的差异，但是目前关于CASC2c对癌症影响的研究却鲜有报道。因此在本实验中，我们着重进行转录体CASC2c在胃癌发生、发展中的作用研究。

在本实验中，通过RT-qPCR检测已经证明CASC2c在胃癌组织及胃癌细胞中低表达，在一定程度上证明了CASC2c与胃癌病理过程的相关性。在此结果的基础上，我们继而研究了CASC2c对胃癌细胞生物学特性的影响及具体作用机制。利用CCK-8法检测胃癌细胞增殖能力，Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力。细胞学实验结果显示，CASC2c表达水平的升高可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖和迁移。细胞学实验进一步证明了CASC2c与胃癌的相关性，说明CASC2c在胃癌的病理过程中发挥抑癌基因的作用。在确定CASC2c对胃癌细胞生物学特性的影响之后，阐述这一影响的具体作用机制成为我们接下来的研究重点。大量的研究报道已经证实，诸多信号通路(如mTOR信号通路)在各种细胞事件中发挥着关键作用：包括调节基因表达、生长、代谢、凋亡和转移。本研究采用Western blot方法筛选CASC2c与信号通路之间的相互关联性。Western blot检测的结果显示，诱导CASC2c的表达后能够使p-ERK1/2和β-catenin的表达水平下调。p-ERK1/2和β-catenin分别为ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子，而ERK1/2表达水平降低表示ERK1/2信号通路处于失活状态。因此推测，CASC2c可能可以抑制ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路的活化。

综上所述，本研究结果显示，CASC2c在胃癌组织和胃癌细胞中低表达，过表达后可通过失活ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路而抑制胃癌细胞增殖和迁移，证实CASC2c对胃癌的发病具有抑制作用，此为胃癌早期诊断和治疗提供了新的思路。

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