世界范围内，食管癌的发病率位于所有恶性肿瘤发病率的第8位，死亡率的第6位，食管癌发病具有明显的地域性，我国是食管癌高发地区[1-3]，常发生于50岁以上男性[4-5]。食管癌包括鳞癌和腺癌两种病理类型，我国食管癌中90%以上为鳞癌[1]。当前主要还是以手术治疗为主，辅以放射治疗和化学治疗。尽管手术治疗和放射治疗取得了很大的进步，但晚期病人术后5年生存率仍低于20% [2]。早期的低确诊率和鳞癌细胞的低分化高增殖水平是导致肿瘤快速进展和转移的重要原因。因此，深入研究食管鳞癌细胞增殖分化的分子生物学机制，寻找新的分子治疗靶点，对食管鳞癌的靶向治疗具有重要意义。Jarid1b是组蛋白3第4位赖氨酸(H3K4)去甲基化酶，属于Jarid1亚科。大量临床研究表明，Jaird1b在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中表达增高[6-11]。上调Jarid1b有助于某些肿瘤细胞增殖，且Jarid1b在许多细胞分化过程中也起到了重要作用，但是Jarid1b对食管肿瘤细胞增殖和分化的作用和分子机制目前研究较少，本研究旨在探讨去甲基化酶Jarid1b对食管鳞癌细胞增殖及分化影响，为食管鳞癌的治疗提供新靶点。

1 材料方法

1.1 细胞培养与慢病毒制作转染

KYSE-150和TE-1细胞购买自上海中国科学院细胞库。细胞培养液为含体积分数0.10胎牛血清的1640和F12(1∶1)混合培养液，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2恒温培养箱中培养。Cumate-pLenti-Jarid1b-SV40-GFP慢病毒质粒购买自美国ABM公司。此质粒为诱导型质粒，仅在cumate诱导时表达Jarid1b。按照Lipofectamin 3000说明书将20 μg Cumate-pLenti-Jarid1b-SV40-GFP、10 μg pCMV-dR8.9和5 μg pMD2.G 三种质粒共转染于直径为10 cm培养皿中生长汇合度为80%左右的293FT细胞中。48 h后收集含有病毒的培养液，放入特殊病毒离心管中，在4 ℃下26 000 r/min离心3 h。弃掉上清液，病毒颗粒沉淀溶于合适体积的培养液中。为了获得纯Jarid1b过表达细胞系，病毒转染KYSE-150细胞24 h后使用2 mg/L的嘌呤霉素筛选细胞直至未转染对照细胞全部死亡。筛选后细胞换无嘌呤霉素培养液继续培养。

1.2 Western Blot检测细胞中各蛋白的表达

以20 g/L SDS裂解液裂解正常的KYSE-150细胞、TE-1细胞和过表达Jarid1b的KYSE-150细胞。裂解产物95 ℃煮10 min，期间每隔3 min剧烈震荡打断DNA。使用BCA法进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳以后以0.3 A恒定电流湿法转膜1.5 h，以50 g/L的脱脂牛奶室温封闭1 h。4 ℃下一抗孵育过夜：CK10(1∶3 000，Abcam，ab76318)，Jarid1b(1∶3 000， Bethyl， A301-813A)， α-tubulin(1∶5 000， Proteintech， 66031-1-Ig)。TBST洗3次，每次10 min。二抗室温孵育1 h，TBST洗3次后采用Super Signal Pico substrate (Pierce Biotechnology)显影，从而得到上述目的蛋白的显影条带。

1.3 RT-qPCR检测目的基因mRNA表达量

按照RNAiso Plus (Takara D9108)说明书分别提取对照组细胞(正常未诱导的KYSE-150细胞)以及实验组的细胞(TE-1细胞、过表达Jarid1b的KYSE-150细胞)的总RNA，并用Nanodrop定量。以逆转录试剂盒(Takara RR037A)逆转录500 ng总RNA后，以转录好的cDNA为模板使用Takara SYBR green试剂盒(RR820A)和罗氏公司Lightcycler480 PCR仪进行荧光定量PCR。PCR引物由华大基因科技公司合成，序列如下：CK10上游引物5′-GGGGGAGCCTCGTGACTA-3′，下游引物5′-AGGCCGTTGATGTCAGCC-3′；CK13上游引物5′-TGCTGCTGGACATCAAGACAC-3′，下游引物5′-AACAGAGGTGCTACGGGGG-3′；GAPDH上游引物5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTT-3′，下游引物5′-GAGTTAAAAGCAGCCCTGGTG-3′。以GPADH为内参基因，采用2-△△CT方法检测实验组及对照组细胞中上述目的基因mRNA的相对表达量。

根据饵料鱼不同的配套模式、设计单产量、上市季节等不同，翘嘴鳜“华康1号”养殖可分为饵料鱼专池饲养和饵料鱼、鳜鱼混养两种模式。它可以按照鳜鱼共性的技术标准、操作规范和生产流程进行养殖，诸如清塘、苗种消毒，或单一品种精养，或多品种立体混养或者轮捕轮放，饲料投喂，开展病害防治以及防灾减灾，同时该鱼养殖也有个性要求。

1.4 CCK8实验检测细胞增殖能力

十队是在60年代末由两个生产队合并而成，所以，在日常劳作中，社员总会习惯性地分成两组。为了公正记录工分，两边各推选一名记分员记录对方的工分，同时还另选一名总记工员，两位记分员每天都要把各个社员的工分汇总到总记工员处。由于社员在一天内经常做不同的工种，如果自己记了本组社员的工分，另一个记分员则要把他们的工分、工种抄回去，所以我们在工分簿上看到很多“√”。当时出工就画一个圈，不出工则打个叉，并作相关说明，以免社员日后翻旧账。

2 结 果

2.1 Jarid1b、CK10及CK13蛋白在食管鳞癌细胞中表达比较

RT-qPCR检测结果显示，低分化KYSE-150细胞系中CK10和CK13的相对表达量分别为1.000±0.000和1.000±0.000，而高分化的TE-1细胞系中CK10和CK13的相对表达量分别为9.851±0.542和18.027±0.626，TE-1细胞中CK10和CK13的表达水平明显高于KYSE-150细胞(t=22.07、38.44，P<0.05)。本研究Western Blot方法检测结果显示，Jarid1b在高分化TE-1中高表达(图1)。

取生长状态良好的未转染KYSE-150细胞(对照组)和可以诱导表达Jarid1b的KYSE-150细胞(实验组)，每组设置5个复孔，每孔将5 000个细胞接种至96孔板中，置于细胞培养箱中培养12 h以后实验组加入200 mg/L cumate(美国Sigma公司，268402)，未诱导对照组加入相应体积无水乙醇。诱导处理后分别在0、24和48 h弃掉培养基，每孔加入新鲜配制的110 μL(含10 μL CCK8检测液)无血清培养基，置于37 ℃培养箱中孵育30 min左右，用酶标仪检测细胞在450 nm波长处的吸光度(A)值。

2.2 过表达Jarid1b对KYSE-150细胞增殖的影响

RT-qPCR检测结果显示，以cumate试剂诱导KYSE-150细胞Jaird1b过表达以后，KYSE-150细胞中CK10以及CK13的相对表达量分别为3.770±0.404和2.355±0.366，而对照组KYSE-150细胞中CK10和CK13的相对表达量分别为1.000±0.000和1.000±0.000，提示KYSE-150细胞中过表达Jarid1b可以使其中的CK10和CK13的表达量明显升高(t=9.70、5.23，P<0.05)。Western Blot检测结果显示，KYSE-150细胞中过表达Jarid1b可以使其中的CK10的蛋白表达量明显升高(图2)

VRIO模型最早由杰恩·巴尼提出[12]。在《从内部寻求竞争优势》一文中，巴尼概括了该模型的核心思想：可持续竞争优势不能通过简单地评估环境机会和威胁，然后仅在高机会、低威胁的环境中通过经营业务来创造，它还依赖于独特的资源和能力，企业可把这些资源和能力应用于环境竞争中。他认为，判断企业特定的资源和能力是优势还是劣势需要回答以下四个问题：(1)企业的资源和能力通过开发机会和抵御威胁能否增加价值？(2)有多少竞争企业已经获得了这些有价值的资源和能力？(3)与已经获得资源和能力的企业相比，不具有某些资源和能力的企业是否面临获取它的成本劣势？(4)企业是否被组织起来开发利用其资源和能力？

2.3 过表达Jarid1b对KYSE-150细胞分化能力的影响

CCK8实验结果显示，200 mg/L cumate诱导Jarid1b表达0、24、48 h后实验组KYSE-150细胞在450 nm波长处的吸光度值分别为0.881±0.053、0.804±0.019、0.920±0.022，而对照组KYSE-150细胞在450 nm波长处的吸光度值分别为0.858±0.061、0.998±0.029、1.171±0.028。24、48 h两组KYSE-150细胞增殖水平比较，差异有显著性(t=10.94、16.71，P<0.05)。

从表3可以看出，不同激励程度的大学生在学习动机各维度上得分有显著差异。比较表明：在求知兴趣、利他取向维度上，认为作用很大的学生得分显著高于认为作用一般、不大的学生；在能力追求、声誉获取上，认为作用很大的学生得分高于认为作用一般的学生，认为作用一般的学生得分显著高于认为作用不大的学生。

  

图1 两种细胞中Jarid1b蛋白的表达

  

图2 过表达Jarid1b对KYSE-150细胞中CK10蛋白表达水平的影响

3 讨 论

Jarid1家族是具有JmjC(催化)结构域的组蛋白去甲基化酶，其中Jarid1b可以移除H3K4me3的甲基基团产生H3K4me2和H3K4me1。位于基因启动子区的H3K4me3是基因转录激活的标志，被移除时基因转录受到抑制。虽然有研究提示Ja-rid1b在很多不同类型肿瘤中表达增高，但是Jarid1b对肿瘤的作用仍存在争议。在某些肿瘤中Jarid1b发挥着原癌基因的作用。在乳腺癌中，基因沉默Jarid1b抑制癌细胞增殖，在动物水平导致移植瘤生长减慢[12-13]。在膀胱癌和肺癌细胞系中siRNA抑制Jarid1b表达后导致sub-G1期细胞增多，抑制了细胞增殖。这一抑制作用可能是通过下调下游基因E2F来实现的[14]。在某些高侵袭性的肿瘤比如三阴性乳腺癌中异常表达的KDM5B可以上调其下游的靶点MALAT1，提升了肿瘤细胞的增殖能力和侵袭性，导致三阴性乳腺癌的低生存率[15]。但是另外一些研究结果提示，Jarid1b可能作为抑癌基因在肿瘤中发挥作用。即Jarid1b可以作为抑制性复合体NuRD的一个新组分，和NuRD复合体的LSD1亚基顺序协同去除H3K4高甲基化，并与其他组分一起抑制趋化因子CCL14的表达，从而抑制乳腺癌细胞转移与血管新生[16]。黑色素瘤中可以分离出一种Jarid1b高表达的细胞亚群，和Jarid1b低表达亚群相比，这一亚群生长缓慢，但是Jarid1b高表达的细胞能产生快速增殖的子代细胞，检测表明这种快速增殖的子代细胞Jarid1b表达明显降低。

此外，Jarid1b在发育过程中对细胞分化具有重要作用。Jarid1b可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化[17]。Jarid1b可以直接下调mir-17-92b表达而导致巨噬细胞的分化[18]。在胚胎干细胞中虽然Jarid1b并非增殖必需，但是其在神经细胞系分化中发挥重要作用[19-20]。在MLL相关白血病干细胞中H3K4me3处于高表达状态。当H3K4me3下降时干细胞分化，Jarid1b是调控H3K4me3下降的主要分子[21]。KIDDER等[22]在胚胎干细胞功能实验中发现，在KDM5B基因缺失的胚胎干细胞的分化和自我更新过程中，存在某些基因体以及增强子区H3K4的广泛甲基化，进而影响这些基因体以及增强子的功能。说明KDM5B在胚胎干细胞的分化过程中起到了重要的作用。

CK主要分布于上皮细胞，其中CK13和CK10的表达程度与上皮细胞的分化水平有良好的相关性[23]。本研究结果显示，相对于低分化食管鳞癌细胞(KYSE-150)，高分化的食管鳞癌细胞(TE-1)中CK10、CK13和Jarid1b的表达水平明显上升，这提示Jarid1b可能是调控食管鳞癌细胞分化的一个重要的因子。我们课题组研究显示，在下咽癌FaDU细胞中上调Jarid1b的表达可以下调其下游靶基因Ship1，继而调控它下游的PI3K/AKT通路活性，抑制该细胞的增殖，并且可以促进其分化[24]。本实验结果显示，过表达Jarid1b使KYSE-150细胞增殖能力明显下降，并且使该细胞中CK10和CK13的表达水平明显上升，提示Jarid1b的过表达可以抑制KYSE-150细胞的增殖并且可以促进该细胞的分化，发挥抑癌基因的作用。这种作用可能是通过Ship1-PI3K/AKT信号网络来实现的，但仍需要更多的实验和临床研究进一步证实。

综上，本研究主要通过诱导Jarid1b过表达的研究方法，证明了Jarid1b过表达抑制了低分化食管鳞癌细胞KYSE-150增殖并且促进其分化，为食管鳞癌甚至其他鳞癌的治疗提供了可能的靶点。

[参考文献]

[1] MONTGOMERY E A, WILD C P. World cancer report 2014 [M]. Lyon:International Agency for Research on Cancer, 2014:374-382.

[2] 李鹏,王拥军,陈光勇,等. 中国早期食管鳞状细胞癌及癌前病变筛查与诊治共识(2015年·北京) [J]. 中国实用内科杂志, 2016(1):20-33.

[3] MA J, GUO X, ZHANG S, et al. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor suppresses proliferation and promotes apoptosis of esophageal squamous cell lines[J]. Mol Med Rep, 2015,11(6):4525-4531.

[4] LIU J S, WANG L, MAO W M, et al. Progress of surgery for esophageal carcinoma[J]. China Cancer, 2013,22(12):953-960.

[5] 夏娟,刘建平,张永恒,等. 食管鳞癌中血管内皮生长因子-C的表达及与淋巴管生成的关系[J]. 现代肿瘤医学, 2016(5):749-753.

[6] 张立伟,马骏,金悦,等. KDM5B基因在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌耐药能力的影响[J]. 现代妇产科进展, 2017,26(3):161-164.

[7] ZHAO L H, LIU H G. Immunohistochemical detection and clinicopathological significance of JARID1B/KDM5B and P16 expression in invasive ductal carcinoma of the breast[J]. Genet Mol Res, 2015,14(2):5417-5426.

[8] SHEN X, ZHUANG Z, ZHANG Y, et al. JARID1B modulates lung cancer cell proliferation and invasion by regulating p53 expression[J]. Tumour Biol, 2015,36(9):7133-7142.

[9] TANG B, QI G, TANG F, et al. JARID1B promotes metastasis and epithelial-mesenchymal transition via PTEN/AKT signaling in hepatocellular carcinoma cells[J]. Oncotarget, 2015,6(14):12723-12739.

[10] WANG Z, TANG F, QI G, et al. KDM5B is overexpressed in gastric cancer and is required for gastric cancer cell proliferation and metastasis[J]. Am J Cancer Res, 2014,5(1):87-100.

[11] TARNOWSKI M, CZEREWATY M, DESKUR A, et al. Expression of cancer testis antigens in colorectal cancer:new prognostic and therapeutic implications[J]. Dis Markers, 2016(16):1987505.

[12] CATCHPOLE S, SPENCER-DENE B, HALL D, et al. PLU-1/JARID1B/KDM5B is required for embryonic survival and contributes to cell proliferation in the mammary gland and in ER+ breast cancer cells[J]. Int J Oncol, 2011,38(5):1267-1277.

[13] YAMANE K, TATEISHI K, KLOSE R J, et al. PLU-1 is an H3K4 demethylase involved in transcriptional repression and breast cancer cell proliferation[J]. Mol Cell, 2007,25(6):801-812.

[14] HAYAMI S, YOSHIMATSU M, VEERAKUMARASIVAM A, et al. Overexpression of the JmjC histone demethylase KDM5B in human carcinogenesis: involvement in the prolife-ration of cancer cells through the E2F/RB pathway[J]. Mol Cancer, 2010,9(1):59.

[15] BAMODU O A, HUANG W C, LEE W H, et al. Aberrant KDM5B expression promotes aggressive breast cancer through MALAT1 overexpression and downregulation of hsa-miR-448[J]. BMC Cancer, 2016,16(1):160.

[16] LI Q, SHI L, GUI B, et al. Binding of the JmjCdemethylase JARID1B to LSD1/NuRD suppresses angiogenesis and metastasis in breast cancer cells by repressing chemokine CCL14[J]. Cancer Res, 2011,71(21):6899-6908.

[17] ROJAS A, AGUILAR R, HENRIQUEZ B, et al. Epigenetic control of the bone-master runx2 gene during osteoblast-lineage commitment by the histone demethylase JARID1B/KDM5B[J]. J Biol Chem, 2015,290(47):28329-28342.

[18] POSPISIL V, VARGOVA K, KOKAVEC J, et al. Epigenetic silencing of the oncogenic miR-17-92 cluster during PU.1-directed macrophage differentiation[J]. EMBO J, 2011,30(21):4450-4464.

[19] ZHOU Q, OBANA E A, RADOMSKI K L, et al. Inhibition of the histone demethylase Kdm5b promotes neurogenesis and derepresses Reln (reelin) in neural stem cells from the adult subventricular zone of mice[J]. Mol Biol Cell, 2016,27(4):627-639.

[20] KIDDER B L, HU G, YU Z X, et al. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b[J]. Mol Cell Biol, 2013,33(24):4793-4810.

[21] WONG S H, GOODE D L, IWASAKI M, et al. The H3K4-methyl epigenome regulates leukemia stem cell oncogenic potential[J]. Cancer Cell, 2015,28(2):198-209.

[22] KIDDER B L, HU G, ZHAO K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation[J]. Genome Biol, 2014,15(2): R32.

[23] 尹文华, 刘素琴, 陈志凌, 等. 细胞角蛋白4和细胞角蛋白13在鼻腔-鼻窦鳞状细胞癌中的表达及临床意义[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2016,23(2):98-101.

[24] ZHANG J, AN X, HAN Y, et al. Overexpression of JARID1B promotes differentiation via SHIP1/AKT signaling in human hypopharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Cell Death Dis, 2016,7(9):e2358.