0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是十分常见的糖尿病并发症。随着生活质量的提高以及饮食习惯的改变，我国糖尿病发病率日益增加，病程5a以上2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)患者合并DR的发生率为24%～40%，病程10a以上T2DM患者合并DR的发生率高达53%～84%[1]。DR是导致成人失明的主要原因之一，所以对于DR的防治及其发病机制的研究具有十分重要的意义。既往研究多认为视网膜微血管病变是引起DR的主要原因，然而越来越多的研究证实在微血管病变发生之前视网膜神经已发生改变[2]。近年来研究发现中药红景天具有多种生物活性，在减轻脑缺血-再灌注损伤、神经元保护和肝保护等多方面发挥重要作用[3-5]。我们推测红景天对于DR的发生、发展也有一定的保护作用。为此，本研究通过构建DR大鼠模型，观察大株红景天注射液对模型大鼠眼部血流的影响，并对其相关机制进行初步探讨，从而为DR的临床治疗提供一定的理论依据。

1材料和方法

1.1材料 SD大鼠90只，体质量203～215g，购自中国科学院斯莱克实验动物中心(SCXK京2011-0012)，购回后适应性饲养2wk后再用于实验。基础饲料、高糖高脂饲料(基础饲料64%，猪油8%，蛋黄粉9%，蔗糖18%，胆酸钠1%)，购自北京博泰宏达生物技术有限公司。链脲佐菌素(Sigma公司，美国)。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(罗氏，瑞士)；Trizol总RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)；逆转录试剂盒(ABI Applied Biosystems，美国)；Real-time PCR试剂盒(Takara，日本)；兔抗大鼠一抗[血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，谷氨酸/天冬氨酸转运体(glutamate/aspartate transporter，GLAST)]、山羊抗兔二抗、DAB显色试剂盒(Santa Cruz，美国)。

1.2方法

1.2.1DR大鼠模型构建及给药 SD大鼠90只随机分为3组：对照组、模型组和干预组，每组30只。对照组大鼠给予基础饲料喂养，模型组和干预组大鼠给予高糖高脂饲料喂养。8wk后，模型组和干预组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(40mg/kg)，对照组大鼠注射等量生理盐水。3d后采集大鼠尾静脉血测血糖，若血糖≥16.7mmol/L，尿糖3+，则视为糖尿病大鼠造模成功。造模成功后继续喂养4wk，各组大鼠饮食情况如前，4wk后行眼底血管荧光造影检查确立大鼠出现DR，则视为DR大鼠造模成功。然后，干预组大鼠腹腔注射大株红景天注射液(规格：10mL/支，国药准字Z20060362，通化玉圣药业股份有限公司)，10mL/次，1次/d。对照组和模型组大鼠注射等量生理盐水。连续干预治疗4wk。

1.2.2大鼠眼部血流测定 采用AD Instrument公司Laser Doppler Flowmetry (LDF)激光血流仪对各组大鼠双眼血流进行检测，为确保检测准确性及均一性，采用眼球固定象限测定法。

2.1.1 子宫出血的特点:月经周期发生紊乱,出血量时少时多,经期的长短不定,有时有大量出血。出血期无下腹痛或其他不适,出血量多或时间长者可伴发贫血症状,大量出血时可导致休克[2]。

1.2.5RT-PCR检测VEGF、GFAP和GLASTmRNA的表达 大鼠视网膜组织，Trizol法提取总RNA，核酸蛋白分析仪进行RNA质量评估。按逆转录试剂盒操作说明，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，引物委托上海生工生物有限公司设计合成。VEGF上游：5’-AAACTGTCAGCTCGGTCAGA-3’，下游：5’-TCAGGGGCCGATTAAAGCTC-3’。GFAP上游：5’-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3’，下游：5’-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3’。GLAST上游：5’-CTACGGAACACAAAAGAGCA-3’，下游：5’-GACAGGGACACAAGCAAACT-3’。GAPDH上游：5’-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3’，下游：5’-ATGCCTGCTTCACCACCACCTTG -3’。扩增条件：94℃ 3min，94℃ 1min，61℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环，72℃ 7min。采用2-△△Ct计算目的基因相对含量。每次实验设置3复孔，所有实验重复5次。

软管都取出来了，王姐还不死心，缠着段主任说：您别放弃呀，求您再给试试呗。段主任摇头说：没必要了。王姐说：那总不能让我妹夫这样过一辈子吧？您再给想想别的办法。段主任说：我这是没办法了，你转到胸外科，看看他们有没有好办法吧。王姐说：成，胸外科我也有熟人，您估计他们有什么好办法？段主任说：开胸。

1.2.3大鼠视网膜组织取材 水合氯醛腹腔麻醉处死大鼠，摘取双侧眼球，取完整的视网膜组织，无菌磷酸缓冲盐溶液洗净，4%甲醛固定，常规脱水、透明，石蜡包埋，切片4μm，-80℃保存，用于TUNEL检测。另取部分视网膜组织-80℃保存，用于RT-PCR和Western blot检测。

1.2.6Westernblot检测VEGF、GFAP和GLAST表达 取大鼠视网膜组织，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，-80℃保存备用。80μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜。TBST漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入兔抗大鼠一抗(VEGF、GFAP、GLAST)工作液(1∶1000)，4℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗工作液(1∶1000)，37℃孵育1h。TBST漂洗，暗室内DAB显色、曝光。Band Scan 5.0系统分析，目的蛋白表达量=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。GAPDH为内参蛋白。实验重复3次。

“我们家的草灰鸭蛋就摆在展示中心展销，我们的客户大多来自铜陵市，在此之前，几乎没有人知道永兴村有这么好的粽子和鸭蛋。”周兴祥说，永兴村的特色农产品是糯稻，村民更是爱包手工粽子。虽然手工粽子品质较好，但由于位置偏僻，以前很少有人主动前来收购。

 

图1 正常大鼠和DR大鼠眼底检查情况A：正常大鼠；B：DR大鼠。

表1 三组大鼠血液流变学指标比较

  

组别n全血粘度(mPa/s)全血粘度高切(mPa/s)全血粘度低切(mPa/s)血沉(mm/h)对照组30142±044438±102683±2051341±533模型组30183±057b667±213b986±314b2167±684b干预组30158±051b，d533±174b，d784±221b，d1638±597b，d F4936138451130714215P<001<001<001<001

注：bP<0.01 vs 对照组；dP<0.01 vs 模型组。

表2 三组大鼠血流动力学指标比较

  

组别nPSV(cm/s)EDV(cm/s)RI对照组302836±671801±234054±009模型组302321±593b587±169b081±011b干预组302547±624b，d675±201b，d069±008b，d F5034841661917P<001<001<001

注：bP<0.01 vs 对照组；dP<0.01 vs 模型组。

2.5三组大鼠VEGF、GFAP和GLASTmRNA表达比较 模型组和干预组大鼠视网膜组织VEGF和GFAP mRNA表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，GLAST mRNA表达显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组大鼠比较，干预组大鼠视网膜组织VEGF和GFAP mRNA表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，而GLAST mRNA表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

2结果

2.1眼底血管荧光造影检查 正常大鼠眼底检查正常，DR大鼠眼底检查可见众多弥散性分布的出血点(图1)。

2.3三组大鼠血流动力学指标 模型组和干预组大鼠眼部血流的PSV和EDV均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，而RI指标均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组大鼠比较，干预组大鼠眼部血流的PSV和EDC均明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，而RI明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

1.2.4TUNEL法检测视网膜细胞凋亡 大鼠眼球组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS洗涤3×5min。加入蛋白酶K(2μg/mL)室温孵育30min，PBS洗涤3×5min。4%多聚甲醛室温固定30min，PBS洗涤3×5min。3% H2O2-甲醇封闭液室温封闭30min，PBS洗涤3×5min。取TUNEL试剂盒，配置Bottle 1和Bottle 2的混合液，每张切片滴加20μL混合液，加盖玻片，室温孵育1h，PBS洗涤3×5min。每张切片加20μL 的Coveter-POD液，加盖玻片，室温孵育30min，PBS洗涤3×5min。DAB室温避光显色，蒸馏水冲洗，封片，光学显微镜400倍下，每组切片选取7个阳性视野，每个视野计数200个细胞，以计算平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡率。

2.2三组大鼠血液流变学指标比较 模型组和干预组大鼠眼部血流的全血粘度、全血粘度高切、全血粘度低切和血沉均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组大鼠比较，干预组大鼠眼部血流的全血粘度、全血粘度高切、全血粘度低切和血沉均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

眼为五官之一，主司视觉，一般认为脏腑气血亏虚是发病的根本。《灵枢·大惑论》曰“五脏六腑之精气，皆上注于目而为之精”，所以精气是视觉产生的物质基础。《审视瑶函·开导之后亦补论》载：“夫目之有血，为养目之源，充和则有发生长养之功，则目不病。少有亏滞，目病生焉”。《审视堪函》又曰：“此症谓目内外无症候，但自视昏妙，朦昧不清也。有神劳，有血少，有元气弱，有元精亏，而昏妙者。”说明该病的发病与气虚血少，精亏液耗有关。本病以中老年为主，中老年人本身受高血压、糖尿病、高脂血症等慢性病的影响，在外感、内伤、饮食、劳倦等诱因下，易致脏腑功能失调，气血疲滞，目系失养，从而导致该病的发生。红景天为多年生草本植物，《神农本草经》将其列为药中上品，具有补肾、理气、养血的作用，久服红景天可轻身益气，不老延年。明·李时珍《本草纲目》载：“红景天，本经上品，祛邪恶气，补诸不足”是“已知补益药中所罕见”。赵红姝等[6]研究证实，高山红景天组方可显著下调DR模型大鼠视网膜组织VEGF的表达，从而有利于DR的治疗。曾丽华等[7]学者研究发现，大株红景天注射液可改善DR患者眼底微循环，促进微血管瘤和出血斑吸收，对患者视力及眼底病变均有较好的改善作用。本研究结果发现，与模型组大鼠比较，红景天干预组大鼠全血粘度、全血粘度高切、全血粘度低切和血沉均明显降低，PSV和EDV明显增加，而RI明显降低。说明大株红景天注射液能显著改善糖尿病视网膜病变模型大鼠眼部血液流变学和血流动力学。

统计学分析：采用SPSS19.0统计学软件进行分析，符合正态分布的计量数据采用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2.6三组大鼠VEGF、GFAP和GLAST蛋白表达比较 模型组和干预组大鼠视网膜组织VEGF和GFAP蛋白表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，GLAST蛋白表达显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组大鼠比较，干预组大鼠视网膜组织VEGF和GFAP蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，而GLAST蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4，图3。

 

图2 TUNEL检测大鼠视网膜细胞凋亡(×400) A、B、C：用DAPI 对细胞核染色；D、E、F：用TUNEL染色的凋亡细胞。

表3 三组大鼠VEGF、GFAP和GLASTmRNA表达比较

  

组别nVEGFGFAPGLAST对照组30011±002017±005113±024模型组30058±019b075±015b059±011b干预组30030±007b，d041±007b，d079±018b，d F12152225565265700P<001<001<001

注：bP<0.01 vs 对照组；dP<0.01 vs 模型组。

表4 三组大鼠VEGF、GFAP和GLAST蛋白表达比较

  

组别nVEGFGFAPGLAST对照组30008±002012±003091±020模型组30051±015b068±010b038±007b干预组30024±009b，d037±009b，d067±014b，d F13712937278998279P<001<001<001

注：bP<0.01 vs 对照组；dP<0.01 vs 模型组。

 

图3 三组大鼠VEGF、GFAP和GLAST蛋白表达比较。

3讨论

2.4三组大鼠视网膜细胞凋亡情况比较 对照组、模型组和干预组大鼠视网膜细胞凋亡率分别为(8.3±1.4)%、(31.2±5.2)%和(19.8±3.5)%。三组大鼠视网膜细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(F=23.417，P<0.01)，模型组和干预组大鼠视网膜细胞凋亡率显著大于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，干预组大鼠视网膜细胞凋亡率较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

既往研究多认为DR是一种糖尿病微血管病变，认为是微血管的病变引起了视网膜神经的改变。然而越来越多的证据显示[8-10]，在糖尿病微血管病变发生之前视网膜神经元和神经胶质细胞就已经发生了改变，主要包括：神经节细胞丢失，神经纤维层变薄，轴突减少，Müller细胞和星形胶质细胞中GFAP表达异常，无长突细胞、水平细胞和光感受器细胞发生退行性改变等。视网膜神经胶质细胞是维持视网膜完整性的关键，Müller细胞是主要的视网膜神经胶质细胞，其功能异常与包括DR在内的等多种视网膜疾病相关[11]。本研究结果显示，与模型组大鼠比较，红景天干预组大鼠视网膜组织GFAP表达明显降低，而GLAST表达明显增加。说明大株红景天注射液可有效下调Müller细胞中GFAP表达，可能与其保护Müller细胞免受外界损伤有关，因为正常情况下，Müller细胞中很少可见GFAP的表达，当视网膜受到外界刺激损伤时，Müller细胞中GFAP表达随之增加。研究显示[12]，在DR发病早期亦可见Müller细胞中GFAP表达增加，且其表达上调发生在微血管病变之前。所以大株红景天注射液可能通过保护Müller细胞而下调GFAP表达。此外，也有可能与大株红景天注射液上调GLAST表达有关。因为，谷氨酸是视网膜主要兴奋性神经递质，然其浓度过高时会对视网膜神经细胞造成明显的毒性作用，Müller细胞膜表面的GLAST可将谷氨酸转运至细胞内，并经细胞内的谷氨酰胺合成酶转化成无毒的谷氨酰胺，从而清除过量谷氨酸引起的视网膜毒性[13-14]。所以大株红景天注射液可通过上调GLAST表达而保护视网膜神经细胞免受谷氨酸的毒性作用。此外，本研究还发现，红景天干预组大鼠视网膜组织VEGF表达较模型组显著下调。DR的主要病理特征表现为视网膜血管内皮细胞增生及新生血管形成等。VEGF被认为是调节内皮细胞增生及新生血管形成的关键细胞因子，是DR发生、发展的中心环节。正常情况下，眼部组织VEGF呈低表达，从而维持眼部血管的完整性。如果VEGF过度表达，则会促进血管内皮细胞增殖和新生血管形成，并增加血管通透性，引起血-视网膜屏障损伤[15]。所以，大株红景天注射液可通过下调VEGF表达，抑制血管内皮细胞增殖和新生血管形成，从而抑制病情的进展。

综上所述，大株红景天注射液能显著改善糖尿病视网膜病变模型大鼠眼部血液流变学和血流动力学，减少模型大鼠视网膜细胞凋亡，下调视网膜组织VEGF和GFAP表达，上调GLAST表达。

参考文献

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12郭敬,柯敏.高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4的影响.中华眼底病杂志2012；28(5)：498-500

13 Zeng K,Yang N,Wang D,etal. Resveratrol Prevents Retinal Dysfunction by Regulating Glutamate Transporters,Glutamine Synthetase Expression and Activity in Diabetic Retina. NeurochemRes 2016；41(5)：1050-1064

14韩芳芳,陈晓敏,柯敏，等.体外不同压力对视网膜Müller细胞的GLAST表达的影响.武汉大学学报(医学版)2016；37(3)：386-389

15肖艳新,岳东,张艳,等.糖尿病视网膜病变患者血清中血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子水平的变化.中华眼底病杂志2013；29(1)：80-82

在图4中，为了尽可能准确地提取幅度和相位误差，保留了误差曲线两端的振荡，为了便于观察比较3子带相位误差，对子带1和子带3进行了移动，数值是2π的整数倍，对结果没有影响。从图中可以看出，3个子带的幅相误差均不相同。

(4)选煤厂入洗能力整体下降。由于煤泥水系统处理能力不足，致使选煤厂不得不降低入洗量，以保证系统正常工作。

随着社会发展，医疗事业得到突飞猛进的发展，医学知识不断更新以应对各种疑难杂症，拯救伤者于危难之中，面对千奇百怪的疑难杂症，医务人员需要不断进行学习，提升自身医疗水平，增加综合职业素质，为社会和谐发展贡献一份力量。继续医学教育是医务人员提升自我医疗水平的极佳路径，随着继续医学教育的推广，已经备受医务人员青睐，使得医疗事业发展平稳且快速。医院图书馆作为医院的信息集合中心，是从事医疗事业的医务人员继续医学教育的最佳场所，而医院图书馆为了满足继续医学教育，也需要不断的增添相应的信息、书籍以供医务人员阅读、学习。文章以此为基础对医院图书馆服务继续医学教育进行研究。