随着喹诺酮类(Fluoroquinolone, FQL)抗菌药物的运用，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)对FQL的耐药性增长趋势稳定[1,2]。目前认为生物膜形成是PA耐药的重要原因之一[3]。黄连素(Berberine又称小檗碱)是我国历史悠久的一种中药，大量研究表明，黄连素与抗菌药物联用能大大提高抗菌活性，减少抗菌药物用量[4]。本研究拟通过体外实验，探讨黄连素和环丙沙星对铜绿假单胞菌生物膜的影响。

1 材料和方法

1.1 体外生物模型的建立及鉴定

实验菌株P0A1为广东省中医院检验科细菌室保留菌株，质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853。PA生物膜构建及鉴定的步骤参照张伟铮等[5]方法。

1.2 分别测定黄连素、环丙沙星抑制PA生物膜形成的MIC值

黄连素标准品来自上海源叶生物科技有限公司，取10 mg溶于10 mL的ddH2O，配制成1m g/mL浓度的药液。环丙沙星标准品由广州南新制药公司惠赠。用LB肉汤稀释成黄连素0.139 g/mL、0.069 g/mL、0.034 g/mL、0.017 g/mL、0.008 7 g/mL、0.004 4 g/mL、0.002 2 g/mL、0.0011 g/mL八个浓度梯度；环丙沙星0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.063 μg/mL、0.032 μg/mL、0.016 μg/mL、0.008 μg/mL、0.004 μg/mL八个浓度梯度分别加入已置入无菌硅胶片的24孔板中每孔2m L。同时设阴性对照孔(未加任何药品只含培养基)。37 ℃培养7 d，隔天换液，分别测定MIC值。

1.3 测定黄连素和环丙沙星的协同抑制生物膜形成作用

环丙沙星和黄连素分别稀释成5个浓度梯度，其中黄连素0.139 g/mL、0.069 g/mL、0.034 g/mL、0.017 g/mL、0.008 7 g/mL和环丙沙星0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.063 μg/mL、0.032 μg/mL、0.016 μg/mL，形成5×5不同浓度比例的联合药敏孔，再每孔加入100UL菌液。37 ℃培养7天，隔天换液，测定联合用药的MIC值，并计算抑菌浓度指数(FIC)。

对本研究两组患者在治疗以后的SF-36评分、MBI评分和ICF总分进行评价，观察组明显比对照组更优，P＜0.05，差异具有统计学意义。详细情况见表1所示。

2 结果

2.1 生物模型的建立及鉴定

当联合用药7 d后，可观察到黄连素 和环丙沙星 浓度抑制生物膜明显。见表1。

2.2 黄连素、环丙沙星分别抑制生物膜形成的MIC测定

让这位身在日本多年的媒体人“不吐不快”的，是当时网络上仍不断交织碰撞的情绪，和这种舆论分野可能带来的严重后果：“我关注网络舆情好几天，觉得如此下去，会带来两大负面影响：第一，大阪总领馆的辛勤努力，会被抹杀，结果会是‘功劳没有，连苦劳也没有’。第二，这一舆情的泛滥，会导致今后中国驻外使领馆在遇到同样的救助问题时，不敢出手，或者束手束脚，影响我国在海外的领事保护工作。因此，我觉得我有责任澄清事实，还大阪总领馆一个公道。”

从生物膜的形成来看，当黄连素浓度为0.139 g/mL时，对生物膜的抑制明显，随着浓度的降低，生物膜形成越来越多，黑色絮状物增加明显。当环丙沙星浓度为0.25 μg/mL时，对生物膜的抑制明显。与不同浓度的黄连素作用7d后硅胶片银染及光学显微镜拍照观察见图1。

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2.3 黄连素与喹诺酮类联合用药协同抑制生物膜形成的MIC测定

实验室保留菌株POA1接种培养1d 后硅胶片可见散落的黑点或黑斑；培养5d 后可见浓厚的黑染絮状膜样物质覆盖，铜绿假单胞菌POA1生物膜模型建立成功。若无黑染絮状膜样物，则为生物膜阴性结果。

  

CBAD

注：A.为0.139 g/mL黄连素作用后的生物膜；B.为0.069 g/mL黄连素作用后的生物膜；C.为0.034 g/mL黄连素作用后的生物膜；D.为0.004 4 g/mL黄连素作用后的生物膜。

 

图1 不同浓度黄连素对PA生物膜形成的抑制作用

 

表1 黄连素、环丙沙星抑制PA生物膜形成的MIC值

  

药物分别测定MIC联合用药MIC黄连素(g/mL)0.1390.034环丙沙星(μg/mL)0.250.063

计算FIC=(0.034/0.139)+(0.06/0.25)≤0.5，表明黄连素和环丙沙星具有协同抑制PA生物膜形成的作用。

3 讨论

铜绿假单胞菌是一种临床上常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血症、烧死感染等多种疾病，在致病性革兰阴性菌排前三位[6]。PA对喹诺酮类药物的耐药机制主要包括以下3个方面[7]：(1)QRDR基因突变。(2)主动外排泵系统。(3)低渗透性作用：包括外膜渗透性减低及生物膜的作用。在生物膜条件下，很多物质(特别是大分子物质)都难以进行正常的物质交换作用，因而对抗菌药物不敏感。黄连素(Berberine又称小檗碱)是一种从毛茛科黄连属植物黄连等的根茎中提炼出的异喹啉类生物碱，分子式C20H19NO5，分子量353。黄连素与抗菌药物联用能大大提高抗菌活性。苏杞敏[8]研究表明，对左氧氟沙星耐药的肺炎克雷伯菌株，经联用黄连素后MIC的下降率20%，可明显减轻细菌耐药 。

本研究通过分别和联合测定黄连素和环丙沙星对PA生物膜形成的MIC值，来观察这两种药物对生物膜形成的影响。分别测定结果显示：当黄连素浓度0.139 g/mL，出现明显的抑制生物膜作用；当环丙沙星浓度0.25 μg/mL，出现明显的抑制生物膜作用，显示黄连素和环丙沙星都可抑制细菌生物膜的形成。提示黄连素在治疗PA感染有一定疗效。联合用药测定结果显示：联合用药后MIC值均有明显下降，显示黄连素和环丙沙星对抑制PA生物膜形成有很好的协同作用，也提示在临床工作中治疗耐FQL的PA感染性疾病时，可尝试联合应用黄连素，以起到提高效果、降低成本和减少耐药的效果。

PA菌的耐药性常见，耐药机制复杂[9]。黄连素与FQL联用对PA菌的其他机制影响还有待于进一步研究。

参考文献

[1] Mouna Ben Nejma,Olfa Sioud,Maha Mastouri. Quinolone-resistant clinical strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from University Hospital in Tunisia[J]. Biotech,2018,8:1.

[2] 席云生，魏华.铜绿假单胞菌耐药性与抗菌药物使用强度相关性分析[J].现代医学与健康研究,2018,16(2):14-16.

[3] 邹自英，刘霞，刘媛.临床分离铜绿假单胞菌耐药机制研究[J].西南国防医药,2018,28(4):360-362.

[4] Guo-Biao Zhang, Swetha Kameswari Maddili,et al. Discovery of natural berberine-derived nitroimidazoles as potentially multi-targeting agents against drug-resistant Escherichia coli[J].Science China Chemistry, 2018, 61(5): 557-568.

[5] 张伟铮，韩菊梅，屈平华等.银翘散抗铜绿假单胞菌生物膜及与阿奇霉素的协同作用[J].中国热带医学,2015,15(6):655-657.

[6] 国家卫生计生委合理用药专家委员会.2015年全国细菌耐药监测报告[J].中国执业药师,2016,13(3):3-8.

[7] Anaïs Potron,Laurent Poirel,Patrice Nordmann. Emerging broad-spectrum resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii: Mechanisms and epidemiology[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2015,45(6):568-585.

[8] 苏杞敏,叶晓光.黄连素联合左氧氟沙星对肺炎克雷伯菌的体外抑菌研究[J].广州医药,2017,48(4):33-37.

[9] Alaa Alhazmi.Pseudomonas aeruginosa-Pathogenesis and Pathogenic Mechanisms[J].Int J Bil ,2015,7(2):44-67.