低氧可以诱发炎性反应，尤其在促炎细胞因子白细胞介素1β(interleukin 1β, IL- 1β)的产生过程中发挥重要作用[1- 2]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种复杂的慢性炎性反应疾病，IL- 1β在AS发生发展中发挥重要的调控作用[3- 5]。研究表明低氧可以作为一种新的危险信号促进AS斑块内巨噬细胞IL- 1β的产生[1, 6]，因此，研究低氧对IL- 1β转录、翻译、成熟和分泌的机制可能对找到治疗AS的新靶点有重要意义。IL- 1β主要来源于巨噬细胞[7]，是固有免疫和炎性反应的主要调节因子。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可促进巨噬细胞IL- 1β的转录和翻译[8]，而IL- 1β的加工和分泌主要通过NOD样受体3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 3, NLRP3)炎性小体激活半胱氨酸天冬蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1, caspase- 1)后介导[9]。有研究表明低氧可放大LPS处理后人巨噬细胞中IL- 1β的表达，且介导细胞适应性低氧反应的主要核转录因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF- 1α)与IL- 1β、caspase- 1在AS斑块巨噬细胞中存在共定位[1]。但低氧对巨噬细胞产生IL- 1β的作用及机制尚不清楚。因而，本文将研究低氧对LPS诱导的巨噬细胞产生IL- 1β的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物：具有C57BL/6J背景的巨噬细胞特异性希佩尔林道蛋白(Von Hippel-Lindau, VHL)基因敲除(VhlΔMac/Apoe-/-)小鼠和同窝对照(Vhlfl/fl/Apoe-/-)小鼠(美国国立卫生研究院Frank J.Gonzalez课题组)。小鼠饲养于首都医科大学实验动物中心SPF级动物房，提取腹腔巨噬细胞所用的小鼠均为8～10周龄。实验动物的使用遵循首都医科大学实验动物管理条例，并通过首都医科大学实验动物伦理委员会的批准。

1.1.2 细胞：Abelson小鼠白血病病毒诱导的肿瘤RAW264.7巨噬细胞细胞系(北京市心肺血管疾病研究所所赠)及小鼠原代腹腔巨噬细胞(从VhlΔMac/Apoe-/-小鼠和同窝对照Vhlfl/fl/Apoe-/-小鼠中提取所得)。

1.1.3 主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、丙酮酸钠(Hyclone公司)；LPS(Sigma-Aldrich公司)；Brewer改良巯基乙醇酸盐肉汤(BD公司)；反转录试剂盒(Promega公司)；RT-qPCR引物(Sangon Biotech公司)；RIPA裂解液(Solarbio公司)；蛋白酶抑制剂HaltTM Protease Inhibitor Cocktail(Thermo Fisher Scientific公司)；核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(凯基生物公司)；β-actin小鼠单克隆抗体、laminB1单克隆一抗和caspase- 1单克隆一抗(Abcam公司)；HIF-1α小鼠单克隆抗体(Novus Biologicals公司)；NLRP3大鼠单克隆一抗(RD公司)；大鼠HRP二抗(中杉金桥生物技术公司)；IL- 1β小鼠单克隆抗体、小鼠HRP二抗和兔HRP二抗(Cell Signaling公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 RAW264.7的细胞培养及分组处理：将RAW264.7培养在含4×10-3 mol/L L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖、1×10-3 mol/L丙酮酸钠、1.5 g/L NaHCO3和10% FBS的DMEM完全培养基中，细胞贴壁8～10 h后，用含1% FBS的上述培养基饥饿培养8～10 h，分别于37 ℃、5% CO2、21% O2的培养箱及37 ℃、5% CO2、2% O2的精密三气细胞培养箱中进行细胞的常氧及低氧培养。

实验分组：1)常氧组：常氧(21% O2)培养24 h；2)常氧+LPS组：常氧培养24 h后LPS(5×10-3 ng/L)培养4 h；3)低氧组：低氧(2% O2)培养24 h；4)低氧+LPS组：低氧培养24 h后LPS培养4 h。

[1]习近平：《把思想政治工作贯穿教育教学全过程，开创我国高等教育事业发展新局面》，《人民日报》2016年12月9日。

实验分组：1)对照组：Vhlfl/fl/Apoe-/-及VhlΔMac/Apoe-/-腹腔巨噬细胞给予PBS；2)LPS组：Vhlfl/fl/Apoe-/-及VhlΔMac/Apoe-/- 腹腔巨噬细胞LPS(50×10-3 ng/L)培养24 h。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞的提取、培养及分组处理：实验前3 d给予小鼠腹腔注射3%巯基乙醇酸钠，每只2 mL。3 d后提取小鼠腹腔巨噬细胞，种于细胞培养皿中，于37 ℃、5% CO2、21% O2的培养箱中培养。

1.2.3 总RNA提取和RT-qPCR检测Vegf、Nlrp3、Il1b、Vhl和Il6的mRNA表达水平：利用Trizol有机溶剂抽提法提取细胞总RNA，定量后利用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA。利用RT-qPCR检测目的基因mRNA的表达水平(引物序列见表1)。

[3] Chamberlain J, Evans D, King A, et al. Interleukin- 1 beta and signaling of interleukin- 1 in vascular wall and circulating cells modulates the extent of neointima forma-tion in mice[J]. Am J Pathol, 2006, 168:1396- 1403.

1.3 统计学分析

利用Graph Pad Prism 7软件进行统计学分析，所有的实验数据都用均数±标准差表示。两组数据之间的比较采用t检验，多组数据之间的比较利用ANOVA方差分析。

2 结果

2.1 低氧可显著升高RAW264.7细胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平

与常氧组相比，低氧能使RAW264.7细胞中Vegf、Nlrp3、Il1b的mRNA水平显著上调(P<0.01)(图1)。

对已有规划的项目要继续推进实施，待现代化发展战略专题研究及相应的发展规划编制完成并批复后，再对工程建设任务目标进行修订调整。考虑天津现状及已有规划，需推进实施的有6项重点工程：

RT-qPCR结果显示，VhlΔMac/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬细胞中Vhl基因的敲除效率为20%以下(P<0.001)。与Vhlfl/fl/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬细胞相比，给予LPS(50×10-3 ng/L 24 h)培养后，VhlΔMac/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬细胞中Nlrp3、Il1b和Il6的mRNA水平显著升高(P<0.05)(图3)。

2.2 低氧可升高LPS诱导的RAW264.7细胞中NLRP3、IL- 1β的mRNA及蛋白水平

与常氧组相比，给予LPS培养后，低氧能显著增加LPS诱导的NLRP3和IL- 1β的mRNA及蛋白水平(P<0.01)，但不能诱导caspase- 1激活及Pro-IL- 1β剪切。此外，与常氧组相比，给予LPS培养后，低氧联合LPS还能升高HIF- 1α的蛋白水平及其经典靶基因Vegf的mRNA水平(P<0.05)(图2)。

 

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

  

geneforwardprimer reverseprimer β-actin5'-ATGGAGGGGAATACAGCCC-3'5'-TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT-3'Vegf5'-ATAGCTTCGCAGAATGCTCAGA-3'5'-CAGTCACCTGGTTGCTGCAA-3'Nlrp35'-AAGTAAGGCCGGAATTCACC-3'5'-AAAATGCCTTGGGAGACTCA-3'Il1b5'-GGTCAAAGGTTTGGAAGCAG-3'5'-TGTGAAATGCCACCTTTTGA-3'Vhl5'-CCAGAAGTCCATCATGGGTC-3'5'-CCCTACCCGATCTTACCACC-3'Il65'-CTGCAGCCACTGGTTCTGT-3'5'-CCAGAGCTGTGCAGATGAGT-3'

  

*P<0.01, **P<0.001 compared with normoxia group图1 低氧可升高RAW264.7细胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平Fig 1 Hypoxia increased the mRNA levels of Nlrp3 and Il1b in RAW264.7 n≥3)

 

RAW264.7 cells were stimulated with 5 ng/mL LPS for 4 hours; A.the mRNA levels of Vegf, Nlrp3 and Il1b were determined by RT-qPCR; B.cell lysates were fractionated by SDS-PAGE and immunoblotted with antibodies to HIF- 1α, NLRP3, caspase- 1, cleaved caspase- 1, Pro-IL- 1β,IL- 1β,β-actin and LaminB1; densitometric analyses of the bands corresponding to HIF- 1α, NLRP3 and Pro-IL- 1β,β-actin and LaminB1 were served as internal control;*P<0.05, **P<0.01 compared with normoxia control group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with LPS stimulation group

图2 低氧可升高RAW264.7细胞中LPS诱导的NLRP3和IL- 1β的mRNA及蛋白水平

Fig 2 Hypoxia increased the mRNA and protein levels of NLRP3 and IL- 1β induced with LPS

2.3 特异性敲除巨噬细胞Vhl可升高LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平

粮仓位于北侧横窑东段，开间4.3m，进深2.9m，高2.5m。仓库内西墙开一高窗（图11），说明此处可以采光或通风，则西墙外必有通风口或采光井存在，这样就证实在贮藏空间东侧确曾有楼梯，将楼梯在上院的出口当做采光或通风口，在其上盖以木板或石板遮挡，使用时掀开，平常关闭，既节省空间，又使通行方便，体现了当时碹窑工匠的先进建造思想及高超技艺。

3 讨论

本研究表明低氧可升高RAW264.7细胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平，放大LPS诱导的NLRP3和IL- 1β mRNA和蛋白水平，促进巨噬细胞IL- 1β的产生，并且特异性敲除巨噬细胞Vhl可显著升高LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平。以上结果表明低氧或Vhl敲除可升高LPS诱导的NLRP3和IL- 1β mRNA及蛋白水平，提示HIFs激活可能在此过程中发挥重要作用。

HIFs是调节氧稳态的主要转录因子，由α和β亚基构成异二聚体，HIFs主要受脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases, PHDs)羟基化后经VHL介导的蛋白酶体途径降解[10]。低氧或敲除Vhl可导致HIFs经蛋白酶体降解途径受阻，HIFs在细胞内积聚并促进其靶基因的转录。有研究表明低氧可通过延长LPS诱导的人巨噬细胞中Pro-IL- 1β的半衰期增加其蛋白水平，但低氧不增加LPS诱导的人巨噬细胞中的IL1β mRNA水平[1]。另一项研究表明低氧可扩大LPS诱导的小鼠骨髓巨噬细胞IL- 1β的分泌[11]。这与本研究结果不完全一致。本研究结果发现低氧不仅可以促进RAW264.7中Nlrp3和Il1b的mRNA水平升高，还可进一步促进LPS诱导的NLRP3和IL- 1β mRNA及蛋白水平升高，但低氧不能诱导Pro-IL- 1β剪切。本研究与以往研究不完全一致的原因可能是由于巨噬细胞种属不同及LPS处理的时间、剂量不同。本研究还发现特异性敲除巨噬细胞Vhl所诱导的HIFs持续激活可进一步升高LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平。研究表明低氧通过HIF- 1α-NLRP3-IL- 1β轴可加重小鼠静脉血栓栓塞[12]，且HIF- 1α可通过促进IL- 1β的转录和分泌参与巨噬细胞IL- 1β产生[11]。在本研究中，HIF- 1α-NLRP3-IL- 1β轴也可能在低氧增强巨噬细胞中LPS诱导的IL- 1β表达过程中发挥重要作用。

 

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Vhlfl/fl/Apoe-/- vehicle group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with Vhlfl/fl/Apoe-/- with LPS stimulation group

图3 特异性敲除巨噬细胞Vhl可升高LPS诱导的Nlrp3和Il1b mRNA水平Fig 3 Macrophage-specific Vhl knockout increased the mRNA levels of Nlrp3 and Il1b induced by n≥3)

综上所述，低氧可能通过激活HIFs升高LPS诱导的巨噬细胞中NLRP3和IL- 1β的mRNA和蛋白水平，进而参与低氧增强巨噬细胞中LPS诱导的IL- 1β表达。然而，低氧调节巨噬细胞IL- 1β产生的机制还需进一步研究。

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8月初，来到江苏镇江市走市场，有一贸易商将5个车皮的山西中颗粒尿素以1900元/吨第一到站一股脑儿出手了，当时还挺开心。上周跟我聊天时说是有点后悔，感觉卖亏了，没想到这一轮普涨来得这么快，来得这么直接。好像现在卖货出去还后悔不迭的人，已经很少见了，丢了几个鄙夷的眼神让慢慢品味。这批货到站很是时候，正是镇江市最佳的水稻施穗肥时。

1.2.4 Western blot检测HIF- 1α、NLRP3、caspase- 1、cleaved caspase- 1、Pro-IL- 1β和IL- 1β的蛋白水平：利用RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白，利用核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白及细胞浆蛋白。蛋白变性后，经SDS-PAGE凝胶分离，转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后，孵育一抗及二抗，利用化学发光法显色发光，随后使用Image J进行吸光度值分析的统计。

参考文献：

我家的房屋格局是，南边两间卧室，中间一间客厅，北边厨房和卫生间。也就是说，大姐睡卧室起夜，影响妻子休息，也影响我休息。我跟大姐说，我睡沙发，半夜我不怕吵。我怕大姐睡沙发伸不开脚手不舒服。妻子却果断地说，大姐想睡沙发，就让她睡沙发。

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为了消除应力波在截断边界上的反射，本文参考文献[15]，计算时采用粘弹性动力边界模拟边界上的应力条件，即分别在边界的法线方向和切线方向设置弹性弹簧和粘性阻尼器来传递和吸收边界处的应力波，具体计算可采用弹簧-阻尼单元来模拟。法向边界及切向边界的阻尼系数和弹簧刚度为：

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