成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)是一组临床表型和基因型具有明显异质性的罕见结缔组织病，其发病率为1/10 000～20 000，主要临床表型包括骨骼脆性增高、反复骨折和骨骼畸形，骨骼外表现包括蓝巩膜、牙本质发育不全和听力异常等[1]。

将1985年的水系沉积物数据导入ArcGIS中，可以看到采样点成均匀点阵分布，间隔2 km,并且有各点不同元素的实测含量值。

目前已发现至少19种致病基因(http://www.le.ac.uk/ge/collagen/)，其中85%～90%由 Ⅰ型胶原编码基因COL1A1和COL1A2突变所致，呈常染色体显性遗传，其他基因突变通过影响Ⅰ型胶原合成、翻译后修饰、折叠、胶原交联、骨骼矿化或成骨细胞分化，导致OI[1]。

国内对罕见的常染色体隐性遗传性OI患者的关注十分有限，遗传学研究也相对匮乏。因此，本研究对一例罕见的OI家系，对其临床表现和致病基因突变研究，以加深对TMEM38B突变所致OI的认识。

1 材料与方法

1.1 对象

患者，男，2岁9月，维吾尔族人，因“反复骨折1年9月”，于2016年就诊于北京协和医院内分泌科。患者为第1胎第1产，母亲孕期平顺，足月顺产，出生体重2.7 kg，身长不详。患者1岁学习走路时出现右胫骨骨折，此后轻微外力下再骨折3次，分别为左胫骨和双股骨骨折，均行外固定治疗。既往史无殊。家族史：父母为近亲婚配(图1)，体健，否认骨折家族史。查体：身高83 cm(小于同性别和同年龄儿童-3SD)，体质量12 kg(位于同性别和同年龄儿童-1SD到中位数)，未见牙本质发育不全，巩膜稍蓝，粗侧听力正常。双下肢呈膝内翻畸形，四肢关节韧带无松弛。无脊柱侧突和后突畸形，胸廓无畸形。

本研究获北京协和医院科研伦理委员会批准，在研究开始前征得患者父母同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床表型评估：在北京协和医院检验科采用常规方法检测血清钙、磷、总碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶和肌酐；采用罗氏电化学发光法检测β-胶原降解产物、25羟维生素D和全段甲状旁腺素。在放射科完成头颅及胸腰椎侧位、双股骨和胫腓骨正位X线平片检查，采用双能X线吸收仪(DXA，GE Lunar公司)测定患者腰椎1- 4、股骨颈和全髋部位骨密度。

1.2.2 致病基因突变检测：采集患者及其父母外周静脉血，提取基因组DNA(采用QIAampDNA Blood Mini试剂盒)。采用二代高通量捕获测序平台(next generation sequence, NGS, Illumina HiSeq2000平台)检测OI致病基因，该平台覆盖19种已知成骨不全症的致病基因(包括COL1A1、 COL1A2、 IFITM5、PPIB、SERPINF1、CRTAP、SERPINH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、PLOD2、P3H1、P4HB、PPIB、SEC24D、SPARC、WNT1和CREB3L1)和700余种其他罕见骨病的候选基因。目标区域碱基覆盖度为98.95%，测序深度达200×。

  

图1 患者家系图Fig 1 Pedigree of the OI family

OI尚无根治性治疗方法，双膦酸盐为最常用的治疗药物， 可通过抑制破骨细胞活性， 增加骨密度，减少骨折发生率。本中心曾报道三例TMEM38B突变患者接受双膦酸盐治疗，治疗后骨密度升高，骨折率下降[2]，但是双膦酸盐在OI ⅪⅤ型中的疗效尚需在大样本患者中进一步证实。

2 结果

2.1 患者临床表型特点

[4] Cabral WA, Ishikawa M, Garten M, et al. Absence of the ER cation channel TMEM38B/TRIC-B disrupts intra-cellular calcium homeostasis and dysregulates collagen synthesis in recessive osteogenesis imperfecta [J]. PLoS Genet, 2016,12:e1006156. doi: 10.1371/journal.pgen.1006156.

2.2 OI致病基因突变分析

NGS采用SOAP aligner 软件对原始数据进行分析，比对多个正常人群单核苷酸多态性数据库，如单核苷酸多态性数据库(dbSNP build 137)，千人基因组计划数据库(the 1 000 Genomes Project)和华大公司内部数据库，以常染色体显性遗传<1%，常染色体隐性遗传<0.5%为阈值，鉴别单核苷酸多态性。进一步分析可能导致蛋白质异常的突变，包括框移突变、无义突变、错义突变和剪切位点突变等。发现患者存在TMEM38B纯合突变：第4外显子507位核苷酸G突变为A(c.507G>A)。Sanger测序证实上述结果。该突变导致169位色氨酸提前终止，产生截短蛋白(p.W169X)，其父母亲均为携带者(图3)。该突变在国内外OI患者中均有致病性报道[2- 4](表1)。

 

A.lateral films of the skull: no wormian bones at the occipital region; B.lateral films of the spine: osteoporosis without vertebral compression fractures; C.anteroposterior films of the femur and tibiofibular: bilateral bowing femurs and tibiofibular with fractures, slender long bone with thin cortices

图2 成骨不全症患者的影像学表现Fig 2 Radiological findings in patient with OI

 

A homozygous mutation of TMEM38B was identified as: c.507G>A in exon 4.this parents were both asymptomatic heterozygous carriers for the mutation

图3 TMEM38B测序结果Fig 3 Sanger sequencing results of the TMEM38B

3 讨论

[7] Yamazaki D, Komazaki S, Nakanishi H, et al. Essential role of the TRIC-B channel in Ca2+ handling of alveolar epithelial cells and in perinatal lung maturation [J]. Development, 2009,136:2355- 2361.

TMEM38B于2012年首次被报道导致OI ⅪⅤ型，该基因位于9q31.2，编码跨膜蛋白38B[5]。跨膜蛋白38B为B型三聚物的细胞内阳离子通道(trimeric intracellular cation channel type B，TRIC-B)，在大多数组织的内质网表达，对维持内质网钙离子释放和储存有重要作用[4，6- 7]。钙离子参与I型胶原的合成、折叠、修饰和分泌等多个环节[4]，Ca2+依赖的激酶/磷酸酶信号通路参与多能间充质干细胞向成骨细胞分化[8- 9]。因此，TMEM38B突变可影响上述多个环节，导致骨骼脆性增加，反复骨折。

目前已报道5种TMEM38B突变导致OI(图4)，本研究首次在维吾尔族患者中发现TMEM38B c.507G>A突变导致ⅪⅤ型OI (表1)。TMEM38B所致OI患者多为中重度临床表型OI，仅少数病情较轻，部分可有蓝灰色巩膜、听力异常和心脏瓣膜异常等骨骼外表现[2- 5, 9- 11]。本例与既往报道的TMEM38B突变患者临床表型类似。

其次，要对种子进行处理，在处理的过程中要分为几个阶段。其一，选择高质量的种子放于55-60℃的温水中进行搅拌，使温度降到30℃左右，之后将种子浸泡2 h；其二，种子浸泡后取出风干，风干后将其置于200 mg/kg赤霉素溶液中浸泡24 h后催芽，并用1%的高锰酸钾溶液浸种30 min，捞出淘干净，再放入55℃温水中浸种，用水量为种子的5倍；其三，在用药水浸泡种子之后，用25℃左右的温水将种子浸泡8-12 h，用细砂搓去种皮上的黏液，洗净后摊开晾一晾，准备播种。

按照凯瑟琳·麦金农的观点，职场性骚扰可以划分为交换型性骚扰和敌意环境型性骚扰。交换型性骚扰一般发生在上下级之间，通常是上级依赖其优势地位对下级提出不受欢迎的性要求，并以升职加薪、雇佣关系的维系、避免裁员等为交换条件。而下级为了维持或改善现有的工作待遇，不得不顺从与上级的无理要求，否则将面临雇佣关系解除、晋升机会丢失、工资待遇降低等不利后果。与交换型性骚扰相较，敌意环境型性骚扰的主体更加广泛，上下级之间、同事之间都有可能发生，甚至是下级对上级也可以产生敌意环境型性骚扰。如何对职场性骚扰的受害者加以救济就成为现代劳动立法需要解决的一个重要问题。劳动法规制职场性骚扰问题具有相当的合理性：

OI临床诊断主要依赖于家族史、骨骼脆性增加和典型的骨骼外表现，影像学检查可以协助诊断，尚缺乏OI特异的生化指标。本例患者主要表现为反复骨折，无OI家族史，仅有巩膜稍蓝的骨骼外表现，因此诊断OI前需要进行鉴别诊断。现已有报道显示超过100种非创伤性疾病可导致骨骼脆性增加，如致密性成骨不全症、Hajdu-Cheney综合征、低磷骨软化、青少年特发性骨质疏松症、骨硬化症和先天性无痛症等[12]。大多数疾病通过临床表现、影像学检查和致病基因突变检测，能够很好地进行鉴别诊断。

针对NGS平台发现的致病突变，采用Primer 3软件设计引物，采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增相应外显子及其与内含子交界区。上游引物序列：5′-CACCCACATTTAAAGTCCC T-3′，下游引物序列：5′-GTGATAGAATTATGGCTCC CT-3′。PCR扩增产物纯化后，用荧光自动测序仪(ABI3700)直接测序，结果与参考序列NM_018112.2比对，以确定患者基因突变位点及类型，进一步与人类基因突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和成骨不全症数据库(http://www.le. ac.uk/ge/collagen/)比对，确定其是否为新型突变位点。

  

1-6.exon 1-6 of TMEM38B图4 已报道的TMEM38B的突变信息(A)和TRIC的分子模式图(B)Fig 4 Previous reported mutation information of TMEM38B(A) and topology model of TRIC channels(B)

 

表1 TMEM38B c.507G>A突变导致的成骨不全症患者表现型Table 1 Summary of phenotypes of OI patients with c.507G>A mutations in TMEM38B

  

familypatient(n)originsexsillencetypeage1stfracture(years)numberoffracturesdeformityBShearinglossDIBPstreatmentefficacyofBPsRef12ChineseHanMOIⅣ1.4-1.62-6nonononoyesBMD↑[2]2-46TurkishMOIⅣ0-20-13variablewhitetoblueNANAyesBMD↑,fracture↓[9]5NATurkeyNANANANANANANANANANA[3]61ChineseUygurMOIⅢ14yesyesnonononointhisresearch

BS.blue sclerae; DI.dentinogenesis imperfecta; BPs.bisphosphonates.

本研究确诊一例以反复轻微外力下骨折为主要表现的维吾尔族OI儿童患者，证实TMEM38B第4外显子纯合突变(c.507G>A，p.W169X)为其致病基因。对于幼年起病、反复骨折的患者，需重视OI的可能，应积极进行致病基因突变检测，有助于明确诊断及指导临床治疗。

[2] Lv F, Xu XJ, Wang JY, et al. Two novel mutations in TMEM38B result in rare autosomal recessive osteogenesis imperfecta [J]. J Hum Genet, 2016, 61:539- 545.

实际上，微课单从其概念上就可以理解，就是一个微小的课程，微小到只包含一个知识点。学生利用该微课能做到解决其中提到的问题即可。

[1] Forlino A, Marini JC. Osteogenesis imperfecta [J]. Lancet, 2016, 387:1657- 1671.

参考文献：

综上所述，沙湾县翠山公园南部地貌是上部松散地层在受构造、地表水、地下水、地震、岩土体因素及人类工程活动影响下，以地表水流冲刷、地表水下渗机械潜蚀及边坡失稳的形式长期发展形成的。本文对翠山公园南部地貌的成因进行了深入分析，将对翠山公园的规划、地质灾害防治及水土流失的防治具有积极的指导作用。

[3] Caparros-Martin JA, Aglan MS, Temtamy S, et al. Molecular spectrum and differential diagnosis in patients referred with sporadic or autosomal recessive osteogenesis imperfecta [J]. Mol Genet Genomic Med, 2016,5:28- 39.

患者幼年起病，主要表现为反复轻微外力下骨折，并逐渐出现双下肢骨骼畸形，巩膜稍蓝，无听力异常及牙本质发育不全等骨骼外表现。患者肝肾功能正常，血钙：2.48 mmol/L(参考范围：2.13～2.70 mmol/L)，磷：1.87 mmol/L(参考范围：1.29～1.94 mmol/L)，总碱性磷酸酶：180 U/L(参考范围：42～390 U/L)，甲状旁腺素：18.5 pg/mL(参考范围：12.0～65.0 pg/mL)，均在正常范围内。25羟维生素D：9.5 ng/mL (参考范围：20～50 ng/mL)，提示维生素D严重缺乏，骨吸收指标β-胶原降解产物浓度：1.55 ng/mL(参考范围：0.26～0.512 ng/mL)，高于正常。骨骼X线片示胸腰椎骨质疏松，双股骨、胫骨弯曲畸形，双股骨和右侧胫骨骨皮质不连续，局部骨痂形成，颅骨未见明显缝间骨(图2)。骨密度：腰椎1-4为0.292 g/cm2(Z评分为-4.97)，股骨颈为0.207 g/cm2(Z评分为-7.55)，全髋为0.275 g/cm2(Z评分为-5.21)。因患者骨折未愈合，仅给予钙剂和维生素D制剂治疗，暂未予双膦酸盐治疗。

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本研究确诊一例以反复轻微外力下骨折为主要表现的OI儿童患者。患者存在低骨密度、长骨纤细且骨皮质菲薄的骨骼特点。生化检查提示维生素D缺乏、骨吸收指标升高。NGS发现TMEM38B第4外显子具有纯合突变(c.507G>A，p.W169X)。

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新中国成立以来，辽宁省共修建各类水利工程11万余处，这些水利工程在防洪、灌溉、排涝、发电及供水等方面发挥了重要作用。但由于许多水利工程没有划定管理和保护范围，致使一些地方侵占、抢占水利工程管理范围内土地，破坏水利工程设施的现象时有发生，严重威胁着水利工程的安全，影响了工程效益的正常发挥。

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(5)稳定运行8 h后，对液硫外输泵(P-303)出口的液硫和气相分别取样，分析液硫中硫化氢含量、酸度以及气相中硫化氢含量;若液硫中硫化氢质量分数仍大于15×10-6，提高流量调节阀FV-31201、FV-31301开度，将流量增至850 m3/h。

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始鉴于河南黄河沿岸的堡夫不谙熟堤防的修筑，雍正帝便抽调千名江南河兵调至河南，对黄河沿岸的堤坝险要地段进行修筑与管理。江南河兵调至河南协助河汛，因此对他们多有优待，但是他们懈怠工作，态度散漫，目无法纪，以致于朝廷虽有调兵协助防务，但是并没有收到实际效果。

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