Zika病毒为黄病毒属、单股正链的RNA病毒。近几年，Zika病毒的爆发严重危害了人类健康。研究发现，孕妇感染Zika病毒与新生儿小头症的发病率升高密切相关[1]。此外，Zika病毒会损害小鼠睾丸的发育[2]，从而影响生殖系统。因此，Zika病毒成为威胁人类健康的重大挑战。Zika病毒侵入细胞后，其基因组RNA通过翻译产生3种结构蛋白(C蛋白、prM蛋白和E蛋白)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[3]。结构蛋白作为病毒结构的组成部分，参与病毒组装；非结构蛋白的协调作用在病毒蛋白成熟、基因组复制及病毒组装中起着重要作用。

Zika病毒进入细胞后，病毒基因组(+)RNA首先在NS5 RNA聚合酶的作用下复制形成双链RNA，该双链RNA随后被NS3解旋形成单链，NS5以(-)RNA为模板继续进行复制，产生(+)RNA[4]。因此，研究Zika病毒NS3的ATP水解和核酸解链功能有助于阐明病毒复制机制，为抑制Zika病毒感染提供新的药物设计思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：trans5α感受态细胞(全式金生物技术公司)；BL21感受态细胞(自制)。

1.1.2 试剂：卡那霉素、IPTG、DTT和ATP(Amresco公司)；RNaseA(TaKaRa公司)；DNaseI(北京瑞达恒辉科技发展有限公司)；His抗体(EMAR公司)；ATPase检测试剂盒(Bioassay Systems公司)；合成标记的DNA(cy3-GCGTCTTTACGGTGCTTAAAACAAA ACAAAACAAAACAAAA和AGCACCGTAAAGACG C-BHQ2)(梓熙生物技术有限公司)；PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)；quick-change体系(Phanta公司)；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)；限制性内切酶、CIP和T4 DNA连接酶(NEB公司)；Ni琼脂糖珠子(Qiagen公司)。

1.2 方法

1.2.1 Zika NS3表达载体的构建：50 μL PCR体系：模板100 ng，10 μmol/L引物1.5 μL，DNA聚合酶1 μL，dNTPs 4 μL，5×缓冲液10 μL，ddH2O补齐体积。NS3引物序列：上游为5′-CGGAATTCGGTGGC AGCGAGAACTTGTATTTCCAGGGAGGTGGTAGTGGA GCTCTATGGGATGTGC-3′，下游为5′-CCGCTCGAGT TACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCTCTTT TCCCAGCGGCA-3′。PCR扩增程序为：95 ℃变性4 min，1个循环；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃继续延伸5 min，1个循环。反应结束后，PCR产物利用胶回收试剂盒回收。回收的产物与pET-28a载体均用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切过夜。载体酶切后加入1 μL CIP酶，置于37 ℃消化1 h，然后进行电泳及胶回收；PCR产物酶切后直接回收。回收后的载体和片段利用T4 DNA连接酶进行连接。连接产物转化trans5α感受态中，挑取单克隆菌落接菌，提取质粒后测序。

我不再说话，走出宿舍区附近的一片乌桕树林。心情像是发黄的火纸，又像是深秋烟雨中飘落的梧桐树叶子。本来没有雨，我感觉天在下雨，雨水凉凉的，像天上落下的泥鳅，一条又一条钻入我的衣领。空气的颜色浑浊的像一坛酱油，整个世界都涂满酱油一样的褐色。空气里有一股烂淤泥的味道，和汽车尾气夹杂在一起，茧一般地把我裹起来，我像一只落魄的小鸟，在饥饿里翻飞。

[2] Govero J, Esakky P, Scheaffer SM, et al. Zika virus infection damages the testes in mice[J]. Nature, 2016,540:438- 442.

[1] Li C, Xu D, Ye Q, et al.Zika virus disrupts neural progenitor development and leads to microcephaly in mice[J].Cell Stem Cell, 2016,19:120- 126.

1.2.3 NS3蛋白纯化：使用30 mL裂解缓冲液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.5% Triton X- 100，20 mg/L RNaseA，20 mg/L DNaseI，10%甘油，1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptin，1 mg/L pepstatin，1 mg/L aprotinin)重悬菌体。冰上超声裂解，总功率200 W，超声5 s，停7 s，共超声20 min。超声结束后，4 ℃18 000 r/min离心45 min。取上清，加入Ni琼脂糖珠子，4 ℃结合4 h后，离心后弃上清，将珠子转移至柱子中，用含30 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.4 mmol/L DTT，30 mmol/L咪唑)洗2次，再用含60 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗2次，然后加入洗脱缓冲液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，500 mmol/L咪唑，1 mmol/L DTT)洗脱。最后，蛋白用2 L透析缓冲液(100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，1 mmol/L DTT)透析过夜。

1.2.4 ATPase活性检测：使用无色透明96孔板，参照试剂盒说明书进行实验。先配制标准磷酸根溶液，用于制作标准曲线。然后将NS3用透析缓冲液稀释成200 nmol/L，将ATP分别稀释成2、1、0.4、0.32和0.2 mmol/L。实验组反应体系为：20 μL反应缓冲液，10 μL酶，10 μL ATP，对照组用透析缓冲液代替酶。反应30 min后，每孔加入200 μL显色液，30 min后使用酶标仪检测A620。

黄病毒NS3对核酸的解链需要ATP水解供能。因此抑制NS3的ATP水解活性可以抑制其核酸解旋活性。已有研究发现，登革热病毒NS3 G198A突变体的ATP水解活性和核酸解旋活性，相比野生型NS3均明显减弱[10]。通过序列比对，将Zika NS3蛋白的该位点进行突变，得到Zika NS3 G198A突变体，并对其酶活性进行研究。结果发现，同登革热病毒NS3一样，Zika NS3 G198A的ATP水解活性以及dsDNA的解旋活性均受到明显抑制。经分析，NS3 G198A通过抑制ATP水解进而抑制了dsDNA解链。之所以G198A对核酸解链的抑制效果低于对ATP水解的抑制效果，可能是由于实验所用dsDNA双链长度较短，只需要较少的ATP供能，便可以达到解链效果。

1.2.6 利用quick-change获得NS3 G198A表达载体：20 μL反应体系如下：模板200 ng，10 μmol/L引物1.5 μL(上游引物序列：5′-CTTGCATCCTGGAGCT GCAAAAACCAGGAGAGTTC-3′；下游引物序列：5′-G AACTCTCCTGGTTTTTGCAGCTCCAGGATGCAAG-3′)，phanta DNA聚合酶1 μL，dNTPs 1 μL，2×缓冲液10 μL，加ddH2O补齐体积。PCR程序为：95 ℃变性4 min，1个循环；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，18个循环；72 ℃继续延伸10 min，1个循环。反应结束后，加入Dpn Ⅰ酶消化模板。然后将反应产物转化trans5α。挑取单克隆，摇菌培养，提质粒后测序。

2 结果

2.1 Zika NS3蛋白的表达和纯化

Zika NS3原核表达克隆构建成功后，转化大肠杆菌BL21菌株，利用Western blot检测Zika NS3蛋白在大肠杆菌的表达(图1A)。然后用Ni琼脂糖珠子对蛋白进行亲和纯化，得到较纯的Zika NS3全长蛋白，其分子质量约为80 ku，与理论计算的NS3分子量相符(图1B)。

  

A.Western blot；B.Coomassie blue staining图1 Zika NS3在大肠杆菌中的表达纯化Fig 1 Expression and purification of Zika NS3 in E. coli

2.2 Zika NS3在体外具有ATP水解活性

Zika NS3水解ATP的结果以双倒数曲线方程的形式呈现(图2)。在该反应条件下，Zika NS3具有ATPase活性，其对ATP水解的最大反应速率为2.76 μmol/(L·min)，Km值为0.11 mmol/L。

  

图2 Zika NS3在体外对ATP的水解活性Fig 2 ATP hydrolysis activity of Zika NS3 in vitro

2.3 Zika NS3在体外具有对dsDNA的解链活性

核酸解链系统利用FRET原理(图3A)，将核酸单链末端分别带上Cy3荧光基团和BHQ2淬灭基团，当二者退火形成双链时，Cy3荧光被BHQ2吸收；当双链被解开后，Cy3荧光被检测到。实验发现，相比不加蛋白的对照组，加入Zika NS3的实验组随着反应时间延长，Cy3荧光值显著增加，解链发生(图3B)。

  

A.system principle；B.dsDNA unwinding图3 Zika NS3在体外对dsDNA的解链活性Fig 3 dsDNA unwinding activity of Zika NS3 in vitro

2.4 Zika NS3 G198A表达纯化

[4] Klema VJ, Padmanabhan R, Choi KH. Flaviviral replication complex: coordination between RNA synthesis and 5′-RNA capping[J]. Viruses,2015,7:4640- 4656.

  

图4 Zika NS3 G198A表达纯化Fig 4 Expression and purification of Zika NS3 G198A

2.5 Zika NS3 G198A水解ATP的活性显著降低

使用等量的Zika NS3野生型(WT)和G198A进行ATP水解反应，结果发现G198A对ATP的水解速率显著低于NS3 WT(图5)。

2.6 Zika NS3 G198A对dsDNA的解链活性降低

使用等量的Zika NS3 WT和G198A进行dsDNA解链实验，结果发现G198A对dsDNA的解链速率明显低于NS3 WT(图6)。

  

图5 Zika NS3WT与G198A对ATP水解活性比较Fig 5 Comparision of ATP hydrolysis activity between Zika NS3 WT and G198A

  

图6 Zika NS3 WT与G198A对dsDNA解链活性比较Fig 6 Comparision of dsDNA unwinding activity between Zika NS3 WT and G198A

3 讨论

综上所述，Zika NS3蛋白在体外具有ATP水解活性和dsDNA解旋活性，且NS3 G198A突变体通过影响NS3的ATP水解活性影响其对dsDNA的解链活性。该结果有助于阐明Zika病毒复制机制，为抑制Zika病毒感染提供新的思路。

在本研究中，首先通过大肠杆菌表达和亲和纯化，得到了Zika NS3蛋白。然后对Zika NS3本身的ATP水解活性和dsDNA的解旋活性进行了检测。结果发现，Zika NS3同其他黄病毒NS3一样[6]，在体外均具有ATP水解活性和dsDNA解旋活性，可以水解ATP并解链dsDNA。

1.2.5 核酸解链实验：将合成的ssDNA用退火缓冲液(100 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，2 mmol/L MgCl2)溶解，配成10 μmol/L母液。配制600 μL退火体系：30 μL cy3标记的核酸，30 μL BHQ2标记的核酸，退火缓冲液补齐。将体系避光放于95 ℃水浴中加热5 min后，自然冷却至室温，即得到dsDNA。每个解链反应体系为100 μL，包含50 nmol/L退火产物，20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，10 mmol/L NaCl，0.1 g/L BSA，5 mmol/L MgCl2， 500 nmol/L NS3，混匀后加入全白不透明96孔板中。用酶标仪检测溶液的荧光值[酶标仪参数：激发光550 nm，发射光620 nm，临界值(cutoff值)610 nm]，待荧光值稳定后，每孔加入终浓度为5 mmol/L的ATP以及500 nmol/L的竞争剂(GCG TCTTTACGGTG CT)，检测荧光值的动力学变化。

除了Zika病毒，黄病毒还包括登革热病毒和乙型脑炎病毒等。经过长期研究，这些黄病毒NS3蛋白的结构和功能已被广泛熟知[5]。NS3蛋白N端蛋白酶(protease)结构域主要发挥蛋白酶功能，通过切割病毒自身蛋白，帮助病毒成熟，此外还能切割宿主细胞免疫相关因子，帮助病毒存活[6- 7]。C端解旋酶(helicase)结构域通过水解ATP供能，解旋双链核酸[8]。NS3与NS5相互配合，共同实现病毒基因组的复制。但目前，对于Zika病毒NS3的研究主要局限在结构方面，而对其功能的研究少有报道[9]。

目前的结构施工图审核智能化技术均以AutoCAD开发平台，在审核过程中，对应的构件信息提取均以二维施工图为基础；而本研究的施工图审核技术是以Revit为平台进行的二次开发，审核过程中所涉及到的构件信息部分均来源于Revit模型中对应构件的属性信息和构件之间的关系信息。对比之下，基于BIM技术的RC框架结构施工图审核技术的优化之处主要包括以下3个方面：

参考文献：

以教促学是低学段学生学习的主要模式。“部编本”教材中极少使用抽象概括的文学形式进行识字教学，转而采用生活化词语的教学，针对这些词语，又开创了不同的模式，教法的创新性改变助力学法的创造性革新，学生为识记这些生活化的字词，就必须收集语言材料，发掘基本词素，通过自我力量主动记忆，从而达到语言的分化和再分化。

人教版高中语文必修教材中现代散文部分的“研讨与练习”题有所变化——“研讨与练习”题的设计倾向于“学生中心”，关注学生对课文的理解以及语文学习的过程。本文试通过对人教版高中语文必修课程中现代散文“研讨与练习”题的研究分析，总结题型特点，探讨“研讨与练习”题的教学策略和方法。

1.2.2 NS3蛋白诱导表达：将NS3表达载体转入BL21，挑取单克隆菌落于5 mL LB培养基中培养，过夜后转入1 L LB中，培养至OD600=1，加入终浓度为0.4 mmol/L 的IPTG。然后将菌置于16 ℃，150 r/min条件下继续培养24 h。诱导结束后，6 000 r/min，离心10 min收集菌体，-20 ℃保存。

德国莱尔浩福二合公司位于德国慕尼黑近郊卡尔斯菲尔德。该公司自1987年起开始致力于开发和生产用于动力总成的噪声检测系统，并一直活跃在面向动力总成的声学早期故障检测和下线质量控制领域中。为了更好地向中国客户提供支持，该公司于2007年在中国上海成立了代表处。

原发灶直径大小是反映乳腺癌特性及其预后的重要参考指标之一。既往研究表明，随着肿瘤病灶直径的增大，非前哨淋巴结转移的比率随之增大[11-15]。 一项包含56项研究的荟萃分析[3]显示， 肿块最大径>2 cm 病人NSLN 转移的风险是肿块最大径≤2 cm病人的2.41倍。本研究中病灶大小>2 cm时，nSLN阳性率为65%(11/17)，病灶大小≤2 cm时，nSLN阳性率为36%(17/47)，前者为后者的1.8倍，与既往研究结果相近。可见原发病灶较大的乳腺癌患者，其非前哨淋巴结发生转移的几率更大。

[3] Apte-Sengupta S, Sirohi D, Kuhn RJ. Coupling of replication and assembly in flaviviruses[J]. Curr Opin Virol, 2014,9:134- 142.

Zika NS3 G198A突变体在大肠杆菌BL21中可以被较好的诱导表达。通过Ni柱亲和纯化可以得到较纯的G198A蛋白(图4)。

2011年至2013年我校能源动力工程专业三届设置卓越班和普通班分别按照相应的培养计划进行分班培养，其培养质量具体见表1：

[5] Luo D, Vasudevan SG, Lescar J. The flavivirus NS2B-NS3 protease-helicase as a target for antiviral drug development[J]. Antiviral Res,2015,118:148- 158.

[6] Li XD, Sun L, Seth RB, et al. Hepatitis C virus protease NS3/4A cleaves mitochondrial antiviral signaling protein off the mitochondria to evade innate immunity[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102:17717- 17722.

我们的做法是：要求每组学生在上交阅读笔记的同时，在附录中注明每个成员的贡献，并进行排序，教师则根据文献的难度和完成情况给每组一个评定分数。然后依据每组内部的排序，给每个学生赋予不同的权重，最终得到每个学生的成绩：

[7] Bera AK, Kuhn RJ, Smith JL. Functional characterization of cis and trans activity of the Flavivirus NS2B-NS3 protease[J]. J Biol Chem,2007,282:12883- 12892.

[8] Pang PS, Jankowsky E, Planet PJ, et al. The hepatitis C viral NS3 protein is a processive DNA helicase with cofactor enhanced RNA unwinding[J]. EMBO J,2002,21:1168- 1176.

[9] Jain R, Coloma J, Garcia-Sastre A, et al. Structure of the NS3 helicase from Zika virus[J]. Nat Struct Mol Biol,2016,23:752- 754.

[10] Matusan AE, Pryor MJ, Davidson AD, et al. Mutagenesis of the Dengue virus type 2 NS3 protein within and outside helicase motifs: effects on enzyme activity and virus replication[J]. J Virol,2001,75:9633- 9643.