外泌体(exosome)是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物学体液中的膜性囊泡[1]，广泛存在于人体大多数体液中如血液、尿液和唾液等[2]，其中包含有蛋白质、RNA、microRNA和DNA片段等[3]多种成分，参与人体许多重要的生理或病理过程，在细胞通讯、细胞迁移、免疫反应和肿瘤细胞增殖等方面起了重要的作用，影响疾病的发生发展[4]。目前，外泌体的生物学研究受到极大关注，其相应的提取和鉴定方法是展开相关研究的重要前提。本研究报道了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)外泌体的一种分离和鉴定方法，为外泌体的深入研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 实验动物：SPF级BALB/C小鼠，雄性8 只，体质量20～30 g[中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，许可证号：SCXK(甘)2015- 0001]。

除上述对照外，在“观察洋葱表皮细胞的质壁分离及质壁分离复原”实验中，则采用“自身对照”，对洋葱表皮细胞实验前后的状态进行比较，学生通过不同的实验过程，真正理解和掌握“对照”原则的内涵。

1.1.1 主要试剂：DMEM/ F1培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(Hyclone 公司)；双抗(青霉素及链霉素，Gibco公司)；PBS缓冲液、CD单克隆抗体(BD公司)；外泌体提取试剂盒(Invitrogeng公司)；细胞裂解、蛋白抽提试剂和ECL化学发光试剂盒(Thermo Fisher公司);兔抗鼠CD9、CD63单克隆抗体 (SBI公司)。

盐酸小檗胺片溶出度测定方法的建立及其体外溶出性能评价 ……………………………………………… 董 宁等（17）：2356

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养：用全骨髓贴壁培养方法进行BMSCs的培养。细胞计数后调整为1×106个/mL后移入25 cm2培养瓶，放置于含5% CO2、37 ℃饱和湿度的细胞培养箱中孵育，72 h后全量换液。此后每2～3 d更换培养液。当原代细胞增殖汇合至80%左右时进行传代，以后每3～5 d传代1 次。

1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定：选择汇合度80%左右第3 代BMSC进行表面鉴定。弃去培养瓶内培养基，加入0.25%胰蛋白酶进行消化离心，离心后的沉淀用1×PBS缓冲液清洗2 遍，进行细胞计数，调整细胞为1×106个/mL，并移入1.5 mL EP管中，每管分别加入CD73抗体、CD105抗体和CD45抗体，37 ℃避光，孵育30 min，再以1×PBS洗涤3 次，行流式细胞分析。

1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离：待细胞增殖状态良好后，血清改为无外泌体血清继续培养。收集培养第3代间充质干细胞的培养上清液，经0.22 μm滤器过滤，再经超滤管浓缩。然后按照提取试剂盒说明书加入相应比例的试剂和浓缩上清，混匀后4 ℃ 孵育过夜，4 ℃，10 000×g离心1 h，然后吸取上清，最后获得的沉淀为外泌体。

1.2.4 外泌体的鉴定

骨髓间充质干细胞的外泌体CD63和CD81呈阳性表达(图4)。

1.2.4.2 Nano-ZS检测外泌体粒径: 将分离得到外泌体沉淀用1 mL经过滤的PBS混匀，然后缓慢注入仪器进行检测，并保存分析数据。

1.2.4.3 流式细胞仪检测外泌体标志物: 经抽提分离得到外泌体沉淀，用100 μL经过滤的PBS混匀，密封冰上保存，CD63和CD81两组抗体染色，标记为CD63和CD81；不染色的外泌体作为阴性对照，标记为阴性对照NC。上机检测。

1.2.4.4 Western blot检测外泌体标志性蛋白: 收集分离得到的外泌体，细胞裂解和蛋白抽提试剂提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配置 5%浓缩胶和 10%分离胶进行 SDS-PAGE电泳。在 S1模式电压80 V和 S2模式120 V电压下分离，250 mA将凝胶上的蛋白湿转到PVDF膜上，2% BSA封闭液室温摇床摇动封闭 1 h，加入兔抗鼠一抗(CD9 1∶1 000; CD63 1∶1 000; GAPDH 1∶1 000) 4 ℃孵育过夜。TBST漂洗后加入羊抗鼠二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，再次TBST漂洗，ECL显色。

2 结果

2.1 小鼠骨髓间充质干细胞表面分子的鉴定

混凝土配合比对外加剂相容性的影响较大，如砂率、石子的形状和级配、水灰比等参数，对混凝土的保水性、流动性、粘聚性、密实性等均有重要影响。另外，有些预拌混凝土厂家为了追求最大利益，用较少的胶凝材料配制较高强度等级的混凝土；用较小的水灰比配制较密实的混凝土，这些都易引起外加剂与水泥的不相容。

为了从学生角度了解此种“理论+实践”教学模式的效果及科学性，笔者对马鞍山师范高等专科学校2011级旅游类专业的学生进行了问卷调查，共发放问卷216份，其中有效问卷212份，有效率98%。问卷包括两个部分：一是学生学习形体礼仪课程前后礼仪表现(题号1～3)；二是学生对该种教学模式的感知(表1)。对问卷的测量采取李克特五点量表(1=“非常不同意”，2=“不同意”，3=“不确定”，4=“同意”，5=“非常同意”)，分值越高，则表示对问卷题项的同意程度越高。

2.2 透射电镜观察外泌体形态

骨髓间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形，大小不均匀，直径约30～100 nm，有完整的膜结构，内含低密度物质(图2)。

  

图1 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞Fig 1 Flow cytometry profile of BMSCs

  

图2 电镜下的外泌体形态Fig 2 Transmission electron micrograph of exosome

2.3 外泌体粒径分析

外泌体平均粒径23.99 nm，粒径主峰61.25 nm。粒子分布系数(polymer dispersity index，PDI)0.517 (图3)。

2.4 流式细胞仪检测外泌体表面标志物

1.2.4.1 电镜检测外泌体: 取分离纯化外泌体10 μL，加入等体积PBS 稀释后滴加于2 mm的载样铜网上，于室温静置1 min 后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3%(w/v) 磷钨酸钠溶液室温负染1 min，用双蒸水轻轻洗1 遍后室温晾干，于透射电子显微镜观察并照相。

2.5 Western blot检测外泌体特异标志蛋白CD9和CD63

[1] Wu J, Qu Z, Fei ZW, et al. Role of stem cell-derived exosomes in cancer.[J]. Oncol Lett, 2017, 13:2855- 2866.

数据统计应用SPSS21.0进行统计分析，计量资料用（± s）表示，组间比较采用t检验，计数资料用n（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

[4] Shao Y, Shen Y, Chen T, et al. The functions and clini-cal applications of tumor-derived exosomes[J]. Oncotarget, 2016, 7:60736- 60751.

3 讨论

目前，外泌体的研究取得了很大的研究进展，但总体还是处于研究的初始阶段并且面临着很多的挑战[5]。外泌体分离与鉴定的研究是该领域探索的重要基础。本研究选取小鼠骨髓间充质干细胞，采用全骨髓贴壁法进行培养，并用流式细胞对其进行了表型鉴定，结果显示符合干细胞的特征；在培养细胞和收集细胞培养上清的过程中进行了改良，该方法也可适用于其他细胞来源外泌体的分离，具有一定的借鉴意义。在细胞增殖状态良好时改用无外泌体血清，保证了细胞的营养需要，较饥饿培养效果更好；通过滤器和超滤管收集细胞培养上清，起到了纯化和浓缩的作用，大大的节省了外泌体提取试剂并且可以获得更多更纯的外泌体； 透射电镜观察提取物，发现背景杂质少，颗粒外观符合外泌体典型特征；用目前较为先进的纳米技术对外泌体进行分析，结果显示：外泌体平均粒径23.99 nm，粒径主峰61.25 nm，均在外泌体理论的粒径范围内；粒子分布系数(PDI)0.517在0.08～0.7之间，证明体系分散度适中，检测结果置信度高；外泌体粒径中20～200 nm范围占70%以上，与外泌体的粒径分布吻合；流式检测外泌体表面标志性蛋白CD6和CD81的表达，均呈阳性，符合外泌体的特征；蛋白CD63和CD9在所有的外泌体中均呈现阳性，Western blot过程中采用两个复孔进行验证，均呈阳性表达，符合外泌体特征。

  

图3 外泌体粒径密度分布Fig 3 Size distribution by intensity of exosome

  

图4 流式细胞检测外泌体标志物Fig 4 Flow cytometry profile of exosome markers

  

图5 Western blot检测外泌体蛋白Fig 5 Expression of CD9 and CD63 in exosome by Western blot

[3] Emanueli C, Shearn AI, Angelini GD, et al. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair[J]. Vascul Pharmacol, 2015, 71:24- 30.

参考文献：

提取的外泌体表达CD63和CD9蛋白(图5)。

[2] Wu Z, Zeng Q, Ke C, et al. Exosomes: small vesicles with big roles in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7:60687- 60697.

第3 代 BMSC:CD45呈阴性表达，CD73和 CD105呈阳性表达(图1)。BMSC表面分子表达情况为∶CD45 0.8%、CD73 98.6%和CD105 95.9%。

综上所述，本研究针对骨髓间充质干细胞外泌体的分离和鉴定是可行的，并具有一定的创新性和借鉴意义，为外泌体的深入研究奠定了实验基础。外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质、DNA、mRNA 和 miRNA等[6]，其作用渐渐为人们所重视，外泌体是由细胞分泌的，可以行使部分细胞功能，在体内的安全性优于细胞疗法，同时他还能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能。外泌体有望成为肿瘤检测和诊断的生物标志物[7]、新型给药途径[8]、基因治疗[9]和无细胞治疗载体[10]，对于疾病的诊断、治疗和预后判断具有重要的研究价值和广阔的应用前景。

由表5可知，4#裂缝样品中含有高温放线菌、魏斯氏菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、片球菌属、糖多孢菌属、短杆菌属等有益菌占比约63%，其中高温放线菌占比约39%，也存在杂菌过多的现象，群落结构好于3#断面样品；我们认为，裂缝的影响主要为杂菌感染，有益菌占比偏低。杂菌感染是由空气中的微生物附着生长于曲块裂缝表面造成。曲块若出现脱壳现象也会引起相应问题。因此，当现用曲出现裂缝或脱壳现象时，应将以上影响进行考量。

本地籍测绘项目位于苏北某市某街道，面积约30 km2，测区内宗地数目多，种类繁杂，而且权属界址点数量比较大，权属关系非常复杂。考虑到该项目规模较大，由多个单位参与完成，牵涉到多种工序衔接，业主方通过招投标实行了测绘监理制度。监理的内容包括本地籍测绘项目实施过程中的质量控制、进度控制、投资控制以及组织协调等多个监理要素。

[5] Tkach M, Théry C. Communication by extracellular vesicles: where we are and where we need to go[J]. In Cell, 2016,164:1226- 1232.

[6] Nedaeinia R, Manian M, Jazayeri MH, et al. Circulating exosomes and exosomal microRNAs as biomarkers in gastrointestinal cancer[J].Cancer Gene Ther, 2017, 24:48- 56.

[7] Zhang X, Pei Z, Chen J, et al. Exosomes for immunoregulation and therapeutic Intervention in cancer[J]. J Cancer, 2016, 7:1081- 1087.

[8] Lai RC, Yeo RW, Tan KH, et al. Exosomes for drug delivery-a novel application for the mesenchymal stem cell[J]. Biotechnology Advances, 2013, 31:543- 551.

[9] Dang XT, Zeng XR. Targeted therapeutic delivery using engineered exosomes and its applications in cardiovascular diseases [J]. Gene, 2016, 575:377- 384.

综上，通过技术经济比较，对于±800 kV滇西北至广东特高压直流输电工程共塔架设段线路，推荐采用提高接地极线绝缘配置的反事故措施，将由操作过电压水平确定的9片170 mm结构高度绝缘子提高到由雷电过电压水平确定的15片170 mm结构高度绝缘子。

[10] Phinney DG, Pittenger MF. Concise review:MSC-derived exosomes for cell-free therapy[J]. Stem Cells, 2017, 35:851- 858.