近年来，中药多成分、多环节、多靶点的系统调节作用和副作用小的特点，显示了其在治疗复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer, ROU)的独特优势，越来越受到临床医生们的青睐。地连二心方是我们根据多年临床经验总结出来的自拟方，通过治疗ROU的临床试验发现其有效率高达91.67%[1]，同时我们发现其对H2O2致L929细胞氧化损伤具有较好的保护作用，然而其详细机制仍未知[2]。本研究拟在此基础上，观察地连二心颗粒对ROU模型大鼠的治疗作用及机制，以期为其临床使用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

地连二心颗粒由生地黄、黄连、连翘、白术、当归、竹叶、黄芪、麦冬、白蔹、灯心草等12味中药组成，原药材经天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)汪鋆植教授进行了鉴定，均为药典规定的药材品种，并在实验室留有药材标本。试验药物制备：将地连二心方药材按照处方配比用10倍水浸泡1 h后，煎煮3次，每次2 h，将3次的滤液合并后，浓缩干燥，按照颗粒剂的制备方法，将其制备成颗粒，其得率为26.81%，批号：20160813，备用。维生素C片(Vit C，华中药业，批号：20161004，规格：0.1 g/片)，维生素B2片(Vit B2，华中药业，批号：20160702，规格：5 mg/片)。

1.2 动物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(200±20)g，由三峡大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2011-0012，分笼饲养，自由饮水和摄食。

1.3 试剂

弗氏完全佐剂(FCA，美国Sigma公司)，抗CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC(杭州联科生物)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase， GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde， MDA)(南京建成)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α， TNF-α)、白介素(interleukin， IL)-1β、IL-6和IL-4、IL-10 ELISA检测试剂盒(深圳达科为)；单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1， MCP-1)、化学趋化因子受体2(C-C chemokine receptor 2， CCR2)和GAPDH引物合成(表1)及Trizol和DEPC(上海生工)；Prime ScriptTM RT reagent Kit、Taq DNA聚合酶(大连宝生物)；NF-κBp65抗体(美国Santa Cruz公司)；β-actin抗体(武汉博士德)；羊抗兔二抗(北京中杉金桥)；总蛋白抽提试剂盒、ECL发光试剂盒、蛋白含量测定试剂盒(南京碧云天)；其他试剂均为市售分析纯。

具体做法是以村集体（村委会）为主体成立农宅合作社，通过转让、租赁、入股、合作经营等方式，将村民闲置的房屋资产整合利用，村民自愿入社，引入专业的旅游企业进行经营，打造休闲旅游、度假养老、娱乐营地等产业，盘活经营现有农村闲置房屋，促进农民当地就业，赋予农民更多的财产权和收益权，入社农民每年不仅有固定的租金，年底还有分红。

国学大书院系列图书本次出版为第一辑，共40册，精选畅销12年的品种全新修订勘校，内容涵盖诸子百家、四书五经、经典诵读、史料史记、国医雅趣、智谋韬略、修身养性等方面，全系列采用进口优质轻型纸全双色+彩色印刷，用纸环保雅致，翻阅可自然平摊，方便阅读，高档大气，更有别致礼盒装。阅读国学经典，涵养底蕴文气，善养浩然之气。

1.4 仪器

电子分析天平(上海天平)；涡旋振荡器(美国奥然)；高速离心机(德国Eppendorf公司)；流式细胞系统(英国Beckman Coulte公司)；酶联免疫检测仪(美国Awareness公司)；脱水机(德国Leica公司)；超薄切片机(奥地利莱卡公司)；摊片烤片机(孝感宏业)；实时荧光定量PCR仪(美国Illumina公司);电泳仪(北京六一)；多功能显微镜及图像分析系统(德国Leica公司)。

表1 荧光定量PCR引物序列

基因名称上游引物序列(5'-3')下游引物序列(5'-3')片段长度(bp)MCP-1TGTCCCAAAGAAGCTGTAGTATTTGTTTCTGATCTCACTTGGTTCTGGTC120CCR2GGAATCTTCTTCATTATCCTCCTGACTGACTACACTTGTTATTACCCCAAAGG112GAPDHCCACATCGCTCAGACACCATGGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT307

1.5 方法

由图2可见，正常组大鼠口腔黏膜上皮层完整、腺体排列规则、结构清晰；模型组大鼠口腔黏膜上皮溶解、破溃形成溃疡，表面有炎性渗出物覆盖，黏膜上皮层出现增厚，固有层内毛细血管扩张充血，血管周围有大量炎性细胞浸润；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后口腔黏膜上皮层完整、黏膜浅层仅有少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润。

参照祁晶等人[3]介绍的方法制作ROU模型，具体方法如下：①抗原乳化剂制备：SD大鼠麻醉后在无菌条件下剥取其口腔黏膜，用0.9%NaCl将口腔黏膜冲洗干净后，将口腔黏膜按1 mL/只加入PBS后匀浆，将匀浆液与完全弗氏佐剂(Freund’s complete adjuvant， FCA)(1∶1)混匀后，放入4℃冰箱中保存备用(现配现用，使用前需混悬)；②ROU模型复制：试验大鼠背部剔毛消毒后，在其脊柱两侧分别取一点注射抗原乳化剂，0.1 mL/点，正常组注射FCA，1次/周，连续7周。

1.3.1 标本处理 常规采集研究对象空腹过夜的EDTA抗凝全血1.0 mL，离心分离上层血浆，置于-80℃保存备用。

对一个一直在坚持做到最好的人来说，到达一个终点的意义不过是证实他的选择和坚持，于此，我更能理解他所说的拿到MS以后对工作和生活影响并不大，因为，很多的变化，早已经发生在他走向侍酒师大师的这一路，潜移默化，一步一个脚印。

1.5.2 动物分组及给药

将ROU大鼠随机分为模型组、地连二心颗粒2.025 g/kg剂量组(根据临床给药剂量换算而成)、地连二心颗粒4.05 g/kg剂量组和维生素组(VitB2 0.027 g/kg+Vc 0.054 g/kg，根据临床给药剂量换算而成)，注射FCA的大鼠作为正常组，每组10只。各组大鼠灌胃给予相应的药物，模型组和正常组灌胃给予相应体积的蒸馏水，1次/d，连续给药3周。

1.5.3 实验动物一般情况及口腔溃疡观察

记录小鼠一般状况，肉眼观察给药第1、2、3周后大鼠口腔黏膜病理变化。

1.5.4 T淋巴细胞亚群检测

模型组血液中MDA含量显著升高，而GSH-Px和SOD活性明显降低，与正常组比较具有统计学差异(P<0.01)；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后GSH-Px和SOD活性明显升高，MDA含量明显降低，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，且随着地连二心颗粒剂量的增加，其作用效果愈加明显(表4)。

1.5.5 血清生化指标的测定

1.5.8 实时定量PCR检测

给药3周后取血，分离血清，按试剂盒说明书标示方法测定血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

经过大量的实验表明，在螺栓连接较为紧密时，两传感器所采样的振动信号基本以振动激励的振动函数为主，此时两信号除振动幅度以外，基本不存在其他差异，也反映出两被联件连接相当紧密受激励部件完全跟随主振器件发生振动。然而，当螺栓连接不紧密，出现松动时，其振动波形包含高次谐波，而高次谐波在本系统中不作为判定条件，属于没有意义的引入杂波，需对其进行滤除。本文选用FPGA进行数字滤波，其主要特点是对不同的应用场合可通过改变FPGA内滤波器的方式来适应不同的应用场合，例如高频振动环境下的滤波并不适用于低频振动环境下的滤波情况，而不需要更换硬件设施，只需将FPGA的代码做更改即可适应不同工作环境[11]。

给药3周后取血，分离血清，按试剂盒说明书标示方法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10含量。

1.5.7 标本收集及病理形态学观察

给药3周后选取溃疡和正常黏膜交界处的口腔黏膜组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片后，进行HE染色，在显微镜下观察病理学改变；另取口腔黏膜组织置于液氮罐内保存，分子生物学实验用。

（3）物流绩效的6个分项指标对中国机械运输设备出口三元边际的影响均显著为正，但每个分项指标对其影响程度不同。这恰好也反应了短板理论，物流绩效6个分项指标是相辅相成的，其中任何一项过低都会影响一国整体的物流水平，而单个的长板也无法对出口国的供应链能力的提高产生显著影响，因此， “一带一路”沿线国家采取综合措施提高整体物流绩效水平才是明智之举。

1.5.6 血清细胞因子水平测定

叶面肥分别在初花期和末花期，每亩用速乐硼、磷酸二氢钾各100-150 g，兑水48 kg喷施1-2次，防止花而不实。

农村电商的发展对实现精准扶贫、促进乡村振兴有重要意义，农村电商人才的缺乏是发展的掣肘，高校具有解决社会发展之需的社会服务责任，校村协同采用多项措施解决人才缺乏问题，助推农村电商的发展。

1.5.9 Western blot检测

按照试剂盒介绍的方法提取口腔黏膜组织总RNA，然后将其反转录为cDNA；取SYBR® Premix Ex TaqTM II (2X) 12.5 μL，然后依次加入PCR Forward Primer(10 μM)1 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)1 μL，dH2O 8.5 μL和DNA模板2 μL，组成25 μL反应体系。然后将其放入实时定量PCR扩增仪中按95℃预变性30 s、95℃变性5 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，扩增40次。利用PCR仪汇出扩增曲线，然后进行结果分析。

按照试剂盒说明书介绍的方法提取口腔黏膜组织蛋白，用超微量核酸蛋白测定仪测定蛋白含量，然后取蛋白上样到10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、转膜，将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭后，NF-κBp65或β-actin一抗4℃孵育过夜；TBS清洗，室温下孵育二抗2 h，TBST清洗；ECL发光，胶片显影、定影。Image J软件测各条带的灰度值，以β-actin为内参，比较各蛋白表达量的变化。

1.6 数据统计分析

实验结果以均数±标准差表示，用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，以单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异，P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况和口腔黏膜观察

造模前各组大鼠活动正常，口腔未见损伤，颜色红润。造模后可见其体重减轻，活动减少，口腔黏膜可见多处肿胀，下齿龈处出现充血红肿和溃疡创面，表明ROU模型制备成功。给药1、2、3周后，正常组大鼠口腔黏膜光滑，颜色红润；模型组大鼠流涎，下齿龈处可见肿胀加重，溃疡创面进一步加大，而且随着时间的延长，肿胀和溃疡愈加严重；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后，大鼠的上述症状均得到了明显改善，且随着时间延长和给药剂量增加，作用效果愈加明显；用地连二心颗粒(4.05 g/kg)治疗3周后，大鼠口腔溃疡基本痊愈(图1)。通过对比分析口腔溃疡个数，发现模型组口腔溃疡个数随着时间的延长有明显的增加；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后溃疡个数明显降低，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)(表2)。

图1 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔黏膜溃疡的影响(箭头所示为溃疡部位)

表2 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔溃疡个数的影响

剂量(g/kg)给药1周给药2周给药3周正常组-0.13±0.040.14±0.020.12±0.03模型组-12.87±2.07##13.46±2.11##14.21±2.54##地连二心颗粒组2.02510.55±2.4110.09±1.17*9.53±1.92**地连二心颗粒组4.059.21±2.18*9.14±1.96**8.26±1.64**维生素组(Vit B2+Vit C)0.027+0.05411.03±2.1110.87±2.039.83±2.23*

注：与同时间点正常组比较，##P<0.01； 与同时间点模型组比较，*P<0.01，**P<0.05

2.2 地连二心颗粒对ROU模型大鼠外周血中淋巴细胞亚群的影响

由表3可见，模型组血液中CD3+、CD4+细胞数量和CD4+/CD8+比值下降，CD8+细胞数量升高，与正常组比较具有统计学差异(P<0.01)；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后CD3+、CD4+和CD8+细胞数量及CD4+/CD8+比值均有效逆转，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，且随着地连二心颗粒剂量的增加，其作用效果愈加明显。

表3 地连二心颗粒对ROU模型大鼠外周血中淋巴细胞亚群的影响

剂量(g/kg)CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+正常组-62.4±4.654.6±3.418.1±1.73.03±0.12模型组-51.0±3.3##45.1±3.2##30.3±3.1##1.49±0.05##地连二心颗粒组2.02556.6±4.2*50.2±3.1*27.0±2.3 1.86±0.07**地连二心颗粒组4.0559.2±3.4**52.2±3.0**24.4±3.0*2.16±0.15**维生素组(Vit B2+Vit C)0.027+0.05457.1±4.5*50.3±3.7*26.3±3.0 1.92±0.09**

注：与正常组比较，##P<0.01； 与模型组比较，*P<0.01，**P<0.05

2.3 地连二心颗粒对ROU模型大鼠血液中GSH-Px、SOD和MDA的影响

实验大鼠于末次给药的次日，取血，分离单个核细胞，用PBS制成悬液，经CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC标记后，用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+细胞数量，计算CD4+/CD8+比值。

2.4 地连二心颗粒对ROU模型大鼠血液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响

由表5可见，模型组血液中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显升高，与正常组比较具有统计学差异(P<0.01)；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后含量明显降低，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

表4 地连二心颗粒对ROU模型大鼠血液中GSH-Px、SOD和MDA的影响

剂量(g/kg)GSH-Px(U/mL)SOD(U/mL)MDA(nmol/mL)正常组-24.2±2.446.7±3.89.7±1.9模型组-13.8±1.4##29.5±7.1##19.1±2.5##地连二心颗粒组2.02517.5±2.7*39.7±5.7*15.2±1.7**地连二心颗粒组4.0519.8±1.7**55.9±5.9**12.5±1.8**维生素组(Vit B2+Vit C)0.027+0.05416.4±1.9*41.7±7.0*14.4±3.0*

注：与正常组比较，##P<0.01； 与模型组比较，*P<0.01，**P<0.05

表5 地连二心颗粒对ROU模型大鼠血液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响

剂量(g/kg)TNF-α(pg/mL)IL-1β(pg/mL)IL-6(pg/mL)正常组-20.7±3.0 14.8±2.912.2±2.0 模型组-55.9±4.6##42.9±2.8##33.8±4.2##地连二心颗粒组2.02545.1±7.2*36.6±4.3**26.6±3.2*地连二心颗粒组4.0534.2±5.8**34.7±3.6**21.6±3.0**维生素组(Vit B2+Vit C)0.027+0.05446.6±6.4*37.52±3.88*27.7±2.9*

注：与正常组比较，##P<0.01； 与模型组比较，*P<0.01，**P<0.05

2.5 地连二心颗粒对ROU模型大鼠血液中IL-4和IL-10含量的影响

由表6可见，模型组血液中抗炎因子IL-4和IL-10含量明显降低，与正常组比较具有统计学差异(P<0.01)；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后血液中含量增加，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

表6 地连二心颗粒对ROU模型大鼠血液中IL-4和IL-10含量的影响

剂量(g/kg)IL-4(pg/mL)IL-10(pg/mL)正常组-12.5±2.5 34.8±5.7 模型组-3.2±0.8##12.8±2.4##地连二心颗粒组2.0255.7±1.2**15.9±1.5*地连二心颗粒组4.058.0±1.4**19.9±1.9**维生素组(Vit B2+Vit C)0.027+0.0544.5±0.7*16.0±1.5*

注：与正常组比较，##P<0.01； 与模型组比较，*P<0.01，**P<0.05

2.6 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔黏膜形态学的影响

1.5.1 抗原乳化剂制备和大鼠ROU模型的复制

图2 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔黏膜形态学的影响(HE染色)

2.7 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔黏膜组织中MCP-1和CCR2 mRNA表达的影响

由表7可见，模型组大鼠黏膜组织中MCP-1和CCR2 mRNA表达明显升高；与正常组比较具有统计学差异(P<0.01)，用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后可使MCP-1和CCR2 mRNA表达明显降低，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

表7 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔黏膜组织中MCP-1、CCR2基因和NF-κBp65蛋白表达的影响

剂量(g/kg)MCP-1/GAPDHCCR2/GAPDHNF-κBp65/β-actin正常组-1.11±0.121.83±0.310.24±0.06模型组-2.73±0.41##3.16±0.47##1.34±0.30##地连二心颗粒组2.0251.98±0.36* 2.38±0.35*0.86±0.22*地连二心颗粒组4.051.77±0.20**1.95±0.32**0.69±0.16**维生素组(Vit B2+Vit C)0.027+0.0542.13±0.22*2.51±0.34*0.90±0.24*

注：与正常组比较，##P<0.01； 与模型组比较，*P<0.01，**P<0.05

2.8 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔黏膜组织中NF-κBp65蛋白表达的影响

由图3和表7可见，模型组大鼠黏膜组织中NF-κBp65蛋白表达明显升高，与正常组比较具有统计学差异(P<0.01)；用地连二心颗粒(2.025、4.05 g/kg)治疗后可使NF-κBp65蛋白表达明显降低，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

注：A: 正常组； B: 模型组； C: 地连二心颗粒2.025 g/kg组； D: 地连二心颗粒4.05 g/kg组； E: 维生素组(Vit B2+Vit C) 图3 地连二心颗粒对ROU模型大鼠口腔黏膜组织 中NF-κBp65蛋白表达的影响

3 讨论

ROU是一类临床上常见的口腔疾病，属于中医的“口疮”、“口糜”等范畴。中医认为本病多为热毒所致，比如过食辛辣、肥甘厚味之品可导致心脾积热，热邪壅盛内传胃腑，淤积于中焦便可化为火邪，循经上攻于口而致；若口腔不洁，湿热毒邪也会乘机侵袭，使口腔肌膜受腐；此外如果长期为“七情”所累，也可导致ROU的发生[4]。现代医学认为ROU的发生与遗传、免疫和神经精神因素有关，其中与免疫功能失调和炎症的异常激活关系最为密切[5]。近年来，我们在临床应用和H2O2致L929细胞氧化损伤模型研究中发现，地连二心方/颗粒对ROU患者和H2O2致L929细胞氧化损伤具有较好的治疗和保护作用，并初步证实抗氧化和抑制细胞凋亡是其重要的作用机制之一。本实验在此基础上，观察其对ROU模型大鼠的治疗作用。实验结果表明，地连二心颗粒能够改善ROU大鼠的一般状况，降低溃疡个数，改善口腔黏膜充血、水肿、糜烂和炎性浸润，调节T淋巴细胞亚群，抑制口腔黏膜组织中NF-κBp65、MCP-1和CCR2表达，恢复促炎因子和抗炎因子之间的平衡，增强内源性抗氧化系统功能，从而对ROU发挥较好的治疗作用。

近年来，国内外学者研究[6，7]发现T淋巴细胞亚群失衡与ROU发生发展密切相关。在正常情况下，CD3+、CD4+和CD8+细胞维持动态平衡，当机体受到物理、化学或生物刺激时，会破坏它们之间的平衡，表现为CD3+和CD4+细胞数量降低、CD8+细胞数量升高、CD4+/CD8+比值下降，免疫功能紊乱，使上皮细胞对各种非特异性和特异性致病因子的易感性增加，导致口腔上皮细胞受损，出现黏膜病变、甚至发生坏死和溃疡。在实验中我们发现模型组血液中T细胞亚群CD3+、CD4+细胞数量和CD4+/CD8+比值下降，CD8+细胞数量升高；用地连二心颗粒处理后可明显逆转上述变化。实验结果证实细胞免疫功能异常与ROU发生发展密切相关，地连二心颗粒可通过调节T淋巴细胞亚群之间的平衡来防治ROU。

活性氧自由基(reactive oxygen species， ROS)是一组具有高度活性和毒性的化合物。在正常生理情况下，少量生成的ROS可迅速被机体内的SOD、GSH-Px等自由基清除酶所清除。如果机体在感染、损伤应激等条件下，激活的巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等均可生成过量活性氧簇，产生过量的ROS，而清除ROS的自由基清除酶相对不足，就使得ROS在体内大量积累，从而对机体造成损伤。在正常情况下，口腔黏膜内皮细胞和成纤维细胞内ROS的产生和清除处于一种动态的平衡。但是患口腔溃疡时，ROS增多，从而使线粒体膜和细胞膜的完整性受到破坏，从而损伤内皮细胞和成纤维细胞。SOD能够通过清除ROS来消除其对细胞造成的损伤，所以SOD的含量与炎症、自身免疫疾病等紧密相关。GSH-Px能促进H2O2降解，而减少MDA生成，进而抑制细胞膜的脂质过氧化发生[8-10]。在实验中，我们发现ROU模型大鼠血液中GSH-Px和SOD水平显著下降，MDA含量显著升高，用地连二心颗粒治疗后可有效逆转上述变化。实验结果表明地连二心颗粒可增强内源性抗氧化系统功能，抑制ROS对口腔黏膜内皮细胞和成纤维细胞的氧化应激损伤。

大量的临床和实验研究证实，当口腔溃疡发生后，口腔黏膜内异常激活的巨噬细胞分泌大量的促炎因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)直接损害黏膜及周围组织，同时还可激活NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶复合体，促进NF-κB移位细胞核，然后与靶基因启动区或增强子上的NF-κB位点结合，启动促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等基因的表达，抑制抗炎因子IL-4和IL-10等的基因表达，使得TNF-α、IL-1β和IL-6等合成和分泌增加，IL-4和IL-10等合成和分泌降低，破坏抗炎因子和促炎因子之间的平衡，从而加剧口腔黏膜损伤。上述促炎因子反过来又可以加速活化NF-κB在口腔黏膜组织间不断扩散及NF-κB核移位，形成恶性循环，从而导致ROU的缠绵难愈[11-14]。本实验结果显示ROU模型大鼠血液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显升高，IL-4和IL-10含量明显降低，口腔黏膜组织中NF-κBp65蛋白表达明显升高，证实ROU发生时可促进NF-κB活化和TNF-α、IL-1β及IL-6的合成和分泌，抑制IL-4和IL-10合成和分泌，该结果与口腔黏膜组织的形态学结果一致。用地连二心颗粒治疗后，上述异常的表达均得到了有效的逆转，口腔黏膜组织形态学也出现了明显的改善。实验结果表明抑制NF-κB核移位，进而调节TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10合成和分泌可能是地连二心颗粒治疗ROU机制之一。

尽可能让老师转变教学主导的身份，给学生留出更多时间和空间，让学生积极实践和思考，探索和交流，实现学生学习方式的真正转变。积极探索微课和翻转课堂在计算机课程实践教学中的整合[5]，调动学生主动学习的兴趣，使微课在实践课程教学中发挥更大的作用，在某种程度上，有利于学生的学习方式向预期目标转变。

近年来的研究表明，MCP-1在ROU转归中发挥着重要的作用。当ROU发生时，溃疡的口腔黏膜分泌的MCP-1迅速与CCR2结合，诱导单核/巨噬细胞向口腔黏膜募集和活化，炎症信号通路被激活，TNF-α、IL-1β和IL-6等分泌增加， IL-4和IL-10等分泌降低，导致口腔黏膜细胞和组织不可逆损伤和坏死[15，16]。实验中，我们发现ROU大鼠口腔黏膜组织MCP-1和CCR2 mRNA表达明显升高；可见ROU大鼠口腔黏膜上皮溶解、破溃形成溃疡，表面有纤维素性渗出物覆盖，黏膜上皮层出现增厚，固有层内毛细血管扩张充血，血管周围有大量炎性细胞浸润；用地连二心颗粒治疗后MCP-1和CCR2 mRNA表达均显著降低，该结果与其对TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10生成，NF-κB活化及形态学影响结果一致。

综上所述，地连二心颗粒对ROU大鼠具有较好的治疗作用。它主要通过逆转CD3+、CD4+和CD8+细胞数量及CD4+/CD8+比值，增强内源性抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性，降低MDA含量，抑制MCP-1/CCR2/NF-κB信号通路激活，进而调节TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10合成和分泌，改善ROU大鼠的一般状况，降低口腔溃疡个数及口腔黏膜充血、水肿、糜烂和炎性浸润来发挥对ROU的治疗作用。

本文第1节主要介绍低电压SRAM测试中的一种比较难以检测的故障:稳定性故障。并且针对低电压SRAM中的稳定性故障,设计出专门的DFT电路来进行对该故障的检测;第2节介绍在March C+算法的基础上,根据故障原语推导相应的新型测试算法来检测更多的故障类型、提高算法的故障覆盖率,最终实现MBIST电路设计;第3节介绍电路仿真结果;第4节给出结论。

参考文献：

[1] 梅 君, 梅和平．地连二心汤治疗复发性口腔溃疡60例临床观察[J]． 时珍国医国药, 2014, 25(11): 封302．

[2] 梅和平, 石孟琼, 陈茂华, 等. 地连二心颗粒对H2O2致小鼠成纤维细胞损伤的保护作用研究[J]． 中药药理与临床, 2017, 33(1): 139-144．

[3] 祁 晶, 余占海, 刘 燕, 等. 免疫法建立SD大鼠RAU模型[J]． 口腔医学研究, 2010, 26(6): 816-819．

[4] 李晓荣, 张晓丽, 李映红, 等. 丹栀逍遥散对复发性口腔溃疡模型相关细胞因子的影响[J]． 深圳中西医结合杂志, 2010, 20 (4): 201-203．

[5] 张明霞, 奚正隆, 李秀阳, 等. 疡宁胶囊抗复发性口腔溃疡的实验研究[J]． 中药药理与临床, 2000, 16 (5): 442-444．

[6] Hamedi S, Sadeghpour O, Shamsardekani M R, et al. The most common herbs to cure the most common oral disease: stomatitis recurrent aphthous ulcer (RAU)[J]． Iran Red Crescent Med J. 2016; 18(2): e21694．

[7] 王雪梅, 薄 磊, 李 欣, 等. 复发性阿弗他溃疡模型大鼠细胞免疫状态与黄芪多糖的干预[J]． 中国组织工程研究与临床康复, 2011; 15(50): 9462-6465．

[8] Dmitrieva L A, Nemeryuk D A, Gerasimova E V, et al. Possibility of combined system enzyme therapy and antioxidants in treatment of periodontal and oral mucosa diseases[J]． Stomatologiia (Mosk), 2015, 94(2): 69-72．

[9] Petti S, Scully C. Polyphenols, oral health and disease: a review[J]． J Dent, 2009, 37(6): 413-423．

[10] 张 洁, 唐荣冰, 赵 倩, 等. 四种口腔溃疡治疗药物对小鼠成纤维细胞氧化应激反应的影响[J]． 中药材, 2014, 37(3): 485-487．

[11] Han J Y, He Z W, Li K, et al. Microarray analysis of potential genes in the pathogenesis of recurrent oral ulcer[J]． Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(10):12419-12427．

[12] Zhang B, Qian X, Ruan S M, et al. Investigation on molecular mechanism of fibroblast regulation and the treatment of recurrent oral ulcer by shuizhongcao granule-containing serum[J]． Evid Based Complement Alternat Med, 2015(9)：324091．

[13] Ceolotto G, Bevilacqua M, Papparella I, et al. Insulin generates free radieals by an NAD(P)H, phosphatidylinositol 3'-kinase-dependent mechanism in human skin fibroblasts ex vivo[J]． Diabetes, 2004, 53 (5):1344-1351．

[14] Sun M, Fu S M, Dong G Y, et al. Inflammatory factors gene polymorphism in recurrent oral ulceration[J]． J Oral Pathol Med, 2013, 42 (7): 528-534．

[15] Martinelli-Kläy C P, Lunardi L O, Martinelli C R, et al. Modulation of MCP-1, TGF-β1, and α-SMA expressions in granulation tissue of cutaneous wounds treated with local Vitamin B complex: an experimental study[J]． Dermatopathology (Basel), 2014, 1(2):98-107．

[16] Fukushima E, Monoi N, Mikoshiba S, et al. Protective effects of acetaminophen on ibuprofen-induced gastric mucosal damage in rats with associated suppression of matrix metalloproteinase[J]． J Pharmacol Exp Ther, 2014, 349 (1):165-173．