干细胞(stem cells)具有多向分化潜能，能在体内分化成多种靶细胞。干细胞移植在多种疾病的临床研究中越来越受到重视[1]。干细胞自身以及分泌的多种生长因子和细胞因子能直接参与到损伤组织的修复中，减少炎症反应、促进血管新生。因此，动态监测干细胞体内移植后的归巢、迁移、分布、增殖及分化等生物学行为至关重要。传统的研究主要是通过病理组织切片来进行评估，然而，这种方法不适用于监测细胞在活体内的生物学行为。近年来，随着研究的不断深入，生物发光成像(bioluminescence imaging，BLI)技术被应用到细胞示踪领域[2，3]，不仅可以无创、实时的评价干细胞移植情况，为客观动态评价干细胞在多种疾病治疗中的作用机制及生物学行为提供可能，还可以减少实验动物的数量以及由于实验动物个体差异而引起的误差。

1 生物发光成像原理

生物发光成像，一般是将报告基因——荧光素酶(包括oplophorus luciferase，firefly luciferase或renilla luciferase 等)基因整合到目的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，并培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶基因也会得到稳定表达，不会丢失。细胞和活体动物都可以被荧光素酶基因所标记。

将标记好荧光素酶基因的细胞接种到实验动物体内后，当外源(一般为腹腔注射或静脉注射)给予其底物荧光素(包括D-luciferin，coelentarizine等)，荧光素酶在ATP和氧气存在的条件下，催化荧光素，氧化生成氧化荧光素(oxyluciferin)，在不需要激发光的情况下，几分钟内便可产生发光现象(图1)。

注：Fluc： 萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)； Rluc： 海肾萤光素酶(renilla luciferase)； Gluc： 高斯荧光素酶(gaussia luciferase)； Oluc：天牛荧光素酶(oplophorus luciferase)； D-luciferin： 荧光素； coelenterazine： 腔肠素； ATP： 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate)； AMP： 腺苷一磷酸(adenosine monophosphate)； O2： 氧气； CO2： 二氧化碳； oxyluciferin： 氧化荧光素； coelenteramide：腔肠酰胺； photon：光子 图1 生物发光成像原理

发射的光可以被高度敏感的电荷耦合元件(charge-coupled device，CCD)相机所探测到，利用活体生物光学成像系统(IVIS 系统)即可实现生物发光的检测，在活体实验动物体内实时监测标记细胞的一系列生物学变化。只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目成线性相关，所以可进一步进行定量分析细胞移植后的滞留率[4，5]。综上所述，生物发光成像技术是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA，再利用灵敏的光学检测仪器，让研究者能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。

性能优越的挖沟机应该具有良好的爬坡、跨越障碍物、抗倾覆等越障性能,良好的越障性能可提升挖沟机车体的稳定性，保证在水平或者斜面上工作时的沟渠挖掘品质.本文提出并设计了一款新型轮腿式[2]挖沟机,综合了轮式和腿式行走机构[3]的优点,可根据地形地貌灵活调整车体姿态[4],有很强的地形地貌适应能力、越障能力和保持车体足够稳定性的能力[5-6].

2 生物发光成像优点

荧光素酶是一种具有生物活性的蛋白质，它在活体内无毒、无放射性、可代谢、可透过各种细胞膜和血脑屏障，且不会影响生物体正常生理功能。生物发光成像，利用报告基因表达的荧光素酶与相应底物发生生化反应[4]，产生从生物体内可探测的光信号，与其他成像技术——磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)和单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography，SPECT)和正电子发射断层成像术(positron emission tomography，PET)相比[6]，具有一系列优势。

2.1 特异性强，无自发荧光

实验动物本身没有任何自发光，因此生物发光成像的背景低、信噪比高。生物发光成像中荧光波长在460～600 nm(如firefly luciferase所发的波长在540～600 nm， renilla luciferase所发的波长在460～540 nm)，其组织穿透能力较强且灵敏度高。以荧光素酶和相应底物的特异性作用而发射荧光，其特异性强，并且可以利用与不同荧光素酶反应后所发射荧光的波长范围不一样，而进行多种酶基因的标记。

在进行某个地区的旅游场地或者产品开发的时候，那么首先要考虑的就是当地相关的文化背景，因为一旦一个旅游产品失去原来的意义，那么它也就没有存在的必要了。根据调查结果显示，有大多数的游客之所以来到某个旅游景点，主要就是为了能够体验一把人文气息，从而使自身精神得到有效的放松，获得情感上的满足。除此以外，旅游产品的展示还需要导游进行辅助，因为有很多的游客都是从远方而来，对当地文化并没有深入的了解，所以这时候就需要导游进行详细的讲解。但是值得注意的是我国导游水平相对较低，甚至有的导游并没有获得专业资格认可，从而也就致使了旅游产品的引入受到了一定的局限[4]。

2.2 高灵敏度

心脏衰竭的心肌干细胞治疗依赖于成功的细胞转移、移植和存活，因此，对移植细胞进行有效的纵向监测很有必要。有报道[14]利用BLI和MRI联合评价诱导多能干细胞的存活率。

2.3 精确定量

干细胞移植治疗可以逆转心室重构、提高左心室顺应性，改善心脏功能，起到心脏修复的作用[15]。生物发光成像通过靶向细胞或疾病的分子途径不仅能在宏观上提供心脏解剖及生理成像，还能在细胞及分子水平上检测生物进程，另外，联合其他分子影像学技术，优势互补，更好的示踪干细胞移植。

3 生物发光成像示踪干细胞移植的应用

3.1 示踪干细胞移植心脏疾病的应用

在急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)方面，有学者[22]通过上调脂质运载蛋白-2(lipocalin-2，Lcn2)的表达，探讨MSCs是否能改善顺铂诱导的大鼠AKI。结果表明，在MSCs中上调Lcn2可有效改善肾功能。并且MSC-Lcn2可上调肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达。利用生物发光技术示踪干细胞移植治疗急性肾缺血，可以更好地分析细胞的作用[5]。

荧光素酶与底物反应后的发光强度与标记细胞的活细胞数目成线性相关[7]，有着较高的敏感性,已有报道[8-10]表明，用高灵敏的探头在体内可以检测最低100个左右被标记的细胞，或每1 mm2可以很容易地检测到20个细胞，酶与底物反应成像背景低、图像清楚、结果直观。

生物发光信号可以用于精确定量，因为荧光素酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶基因也会得到稳定的表达，单位细胞的发光数量很稳定。即便被标记的细胞在实验动物体内有复杂的定位，也可从动物体表接收到的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。

3.2 示踪干细胞移植下肢缺血的应用

图6对比了信号模拟器输出的多普勒信号与接收机测量的速度测量结果，并给出了测量残差。从测速结果得出，每0.2 s得出一个测速结果，速度测量的标准偏差为8.01×10-4m/s，测速系统的测速范围达到了 0.008 5 m/s～22.6 km/s。

3.3 示踪干细胞移植肾脏疾病的应用

干细胞具有保护和改善肾组织结构和功能的作用。干细胞能通过复杂的旁分泌行为起到肾脏保护作用，促使肾脏巨噬细胞表达多种炎症免疫因子，其中白介素1(interleukin，IL-1)通过提高肾小球上皮细胞中的细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、血管粘附分子1(vascular adhesion molecule，VCAM-1)的合成，在糖尿病肾病模型中能增加肾脏近端小管上皮细胞的透明质酸。不仅如此，干细胞还能起到抗尿蛋白的作用，更重要的是它能减少足突细胞的消失、阻止尿蛋白的发展和肾小球硬化症的发生。早期间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs) 干预可以通过免疫调节来预防糖尿病大鼠的肾脏损伤，恢复免疫微环境的稳态，从而延缓肾功能障碍和肾小球硬化的进程而保护肾脏[21]。

MSCs在治疗肝脏疾病方面有一定的前景。然而，肝内移植后MSCs存活时间短，限制了干细胞的应用价值；因此，了解MSCs生存和消逝的机制可能会增加其效用。有报道[23]用Luc2-mKate2双融合报告基因对人类MSCs进行标记(简称为MSCs-R)，肝内移植后，通过活体BLI对MSCs-R的停留时间和存活时间进行评价。并证实了活的MSCs和荧光素酶活性之间存在线性关系(R2=0.995 6)。在体内，观察到在对照组和自然杀伤细胞(natural killer, NK)激活组中，移植的MSCs-R在与肝脏对应的区域上的生物荧光信号逐渐减少。然而，与对照组相比，在NK细胞激活组小鼠中，肝内MSCs-R的存活时间和滞留率下降更快。这表明活化的NK细胞加速了移植的MSCs的清除，可以从MSCs的信号丢失中推断出来。这一发现可能对MSCs移植治疗肝病有实际的临床意义。另有研究者利用生物发光成像技术对急性肝损伤小鼠MSCs的移植剂量和路径进行优化[24]。

近年来，分子成像技术已成为细胞再生医学的必要条件。分子成像技术的发展，如报告基因技术，已经成为非侵入性方法，用于评估应用细胞移植治疗心血管疾病后细胞命运和生物学行为的监测。在这种背景下，生物发光成像是临床前研究中最常用的成像方法。在此，有不少研究者[11-13]提出利用报告基因成像方法，以监测心肌缺血再灌注损伤小鼠模型中移植干细胞的生存能力和生物学特性。

3.4 示踪干细胞移植肝脏疾病的应用

朱熹撰写各体石刻文，尊重并且突出各体的体制特点。同为碑文，祀庙碑与神道碑风格不同。墓表、墓志铭、墓记、圹志等名不同，实也不同。从文体格式来看，碑志文末尾皆有一段铭文，与前面的散体叙述相互配合，抒发情感，提升主题。但铭文一般以四言韵文为主，容易给人以程式化的感觉。韩愈号称一代文宗，又擅长碑志文写作，他煞费苦心，对程式化的铭文进行改造，使之灵活多样、变化多端。在这一点上，朱熹对韩愈亦步亦趋，其碑志铭文不拘一格，形式常新。如《朝奉刘公墓表》铭文是柏梁体的七言诗：

外周血管性疾病(peripheral artery disease，PAD)中的下肢缺血性疾病有较高的致残和致死率[16]，下肢缺血性疾病通常采用微创外科介入治疗，如经皮穿刺血管成形术、支架植入术和动脉搭桥手术等。然而，大量下肢缺血患者的截肢率成为了手术治疗局限性的证据。所以作为一种新型的治疗方法，干细胞移植显示出了很大的应用前景[17]。长期监测细胞移植后的变化及滞留率很有必要。利用生物发光技术的优势，实时观察移植后细胞的改变，有助于对下肢缺血性疾病的研究[18-20]。

也有不少研究者利用生物发光成像和其他影像技术结合，多模态成像获得最大信号来预测细胞或组织移植的最佳时间范围[25]以及细胞的急性保留和长期移植效果[26]。

规划水资源论证工作是近年才启动的新工作，目前还处于探索阶段，本文结合湖南省长沙市大河西先导区规划水资源论证工作，浅谈论证的技术路线及遇到的几个问题，并提出相应建议。

3.5 示踪干细胞移植神经系统疾病的应用

生物发光成像技术在近十年中成功实现了纵向监测移植干细胞的生物分布和命运。然而，在像大脑这样的深层组织中，对移植干细胞的纵向成像仍然具有挑战性。有研究者[27]利用人骨髓MSCs标记上一种新的生物荧光-近红外荧光融合报告基因，移植于小鼠大脑皮层。进行荧光和生物发光成像，通过荧光信号的变化来反映人骨髓MSCs被移植到大脑皮层后的持续生存能力。还有报道[28]利用生物发光成像技术对小鼠脑神经干细胞迁移定量监测。

4 总结与展望

干细胞移植治疗缺血性疾病具有很大的应用前景，动态观测细胞移植后的生物学变化，有助于干细胞移植的临床前研究。生物发光成像利用报告基因，将荧光素酶基因稳定的表达在目的细胞或实验动物体内，酶和底物特异性结合显像。即使生物发光成像存在一些不可避免的缺陷，如需要外源给予底物才能发光，只能显示二维图像等，但可以联合应用多种分子影像学技术，通过多模态成像提高生物发光成像技术在干细胞示踪方面的应用价值[29]，从而客观动态评价干细胞在疾病治疗中的作用机制及生物学行为，有助于临床前的研究。

综上所述，临床前研究有助于理解干细胞治疗疾病的机制及生物学行为。多模态则能实时动态地评估干细胞的生物学特征，为干细胞治疗疾病提供良好的基础。

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