Ostwald和MacLennan在1974年成功分离出钙网蛋白(calreticulin, CRT)，并于1989成功克隆完整的CRT基因[1-3]。CRT是内质网(endoplasmic reticulum，ER)中高度保守的钙结合蛋白，可特异性的结合靶标糖蛋白以帮助其折叠[4]，因此有助于加强CD8+T细胞的识别功能[5]。此外，CRT在调控内质网功能上有着重要的作用。最近的研究发现，肿瘤细胞在发生凋亡的过程中，CRT可先于磷脂酰丝氨酸外翻到调亡细胞表面，因此CRT可以作为细胞凋亡、预凋亡及肿瘤细胞的标记分子[6-10]，成为具有巨大潜力的肿瘤生物治疗靶标分子。

鉴于CRT在肿瘤治疗方面的潜在应用价值，通过原核表达并纯化CRT重组蛋白可为CRT应用研究提供研究材料。目前真核基因的原核表达大多采用大肠杆菌T7诱导系统，然而研究发现，由于克隆方法、重组蛋白毒性、蛋白的修饰折叠以及溶解度等潜在问题，常常无法达到诱导出大量所需蛋白的要求[11，12]。也有研究发现，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(inducerisopropyI-β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导CRT重组蛋白表达结果不够理想[13]。本实验对重组蛋白CRT原核表达条件进行优化，发现通过非IPTG诱导的微量乳糖依赖法可在一定程度提高重组蛋白CRT的原核系统表达量，这种方法可为进一步研究CRT的生物学功能提供足量研究材料。

Application of appropriate ecological energy-saving technology in reconstruction design of existing buildings

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级KM雌性小鼠购于三峡大学实验动物中心，体重18～22 g；Trizol总RNA提取试剂购买于赛默飞世尔公司；反转录PCR试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物纯化试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司； 菌株BL21和质粒pET-15b于肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室保存；兔抗鼠多克隆抗体以及辣根过氧化物酢-IgG购于武汉博士德生物工程有限公司；所有引物的合成以及后续的测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

北方春旱严重，沂蒙山区亦是如此。为了保证收成，勤劳的父老乡亲们有的正在田间地头忙着给麦田灌溉、追肥、松土、锄草，村北头的机井正在抽水，一股股清澈的水流灌溉滋养了农田，肥壮的麦子迎风点头，似乎表达对农人的感谢。河边，带着围巾的女人们拿了马扎、搓板，提了一篮子衣服，来水渠边清洗。她们要把过冬的衣裳和被单在河湾里漂洗干净。家里的洗衣机哪里有到这里来清洗省钱呢？她们时而揉搓，时而用棒槌捶打，间或站起来用力拧干衣服，手里忙着，嘴巴也不闲着，妇人们又说又笑，像群唧唧喳喳的鸟儿。

1.2 CRT的克隆以及原核表达重组质粒pET-15b-CRT的构建

收集不同诱导方法(1 mM IPTG 37℃诱导6 h和30℃自诱导24 h)的菌体，等量称重后于50 mL的10 mM咪唑溶液(1.75% NaCl、0.78% NaH2PO4、10 mM咪唑)中重悬，随后于超声仪中超声破碎(330 W)至溶液澄清。超声后于超速离心机中分离上清(8 000 g×20 min)，并用Ni-NTA树脂对重组蛋白进行亲和层析纯化。重组蛋白用10 mM、30 mM、50 mM和100 mM的咪唑溶液梯度洗脱，洗脱液收集后经聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。含有高纯度重组蛋白的洗脱液经透析浓缩后用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。

1.3 IPTG诱导重组蛋白CRT的表达

将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆菌扩增后，接种于3 mL氨苄抗性的培养基中37℃培养至OD600为0.6～0.8之间。菌液分别加入0 mM、0.1 mM、0.5 mM、1.0 mM的IPTG于28℃和37℃诱导6 h、12 h。收集各个时间点的菌液于离心管内，5 000 rpm，5 min离心收集菌体，裂解后经聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。

1.4 自诱导重组蛋白CRT的表达

通过不同IPTG浓度(0.1 mM，0.5 mM，1.0 mM)，不同时间(6 h, 12 h)以及不同温度(28℃, 37℃)的条件下诱导发现重组蛋白的表达量很少(图3)。经过多种条件的优化，发现在不加IPTG 30℃诱导16 h后目的蛋白表达量少，随后于20 h表达量达到最高值(图4)。

1.5 重组蛋白CRT的纯化及产率计算

将雌性KM小鼠脱颈处死后，迅速分离出肝脏并于-80℃冰箱冷冻处理。称取约0.2 g左右的冰冻肝脏于1.5 mL的EP管内低温研磨后均浆。取均浆液利用Trizol法提取肝脏总RNA，根据反转录试剂盒说明制备cDNA。随后利用CRT(Genebank No.EU639407)特异性上游引物5′-TGTGGGATTTCCGCCATGCTCCTTT-3′(BamHI)和下游引物5′-TGTACTCGAGCTACAGCTCATCCTTGGCTTG-3′(XhoI)进行扩增。将原核表达质粒pET-15b和PCR产物同时进行双酶切，连接转化后，提取质粒测序。

1.6 Western blot分析重组蛋白CRT

由于CRT重组蛋白中含有His标签，本研究利用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示，得到的CRT重组蛋白纯度较高，分子量大小与理论预期值一致(图5)。Western blot分析发现，纯化的重组蛋白能被CRT抗体特异性识别，说明其具有良好的抗原性。通过对两种诱导方式诱导的重组蛋白CRT的产率分析，发现不加入IPTG时在30℃诱导20 h比37℃1.0 mM IPTG诱导6 h的产率大约高6.29倍(表1)。因此，这种方法诱导的重组蛋白CRT达到了实验的需求量，可作为一种CRT的理想诱导方法。

2 结果

2.1 CRT的克隆及原核表达质粒的构建

根据MEMS陀螺上述随机信号的特点,该文中使用的SHAKF滤波器[4]能够在系统模型参数不够准确时,根据量测输出对部分参数进行重新估计。

从小鼠肝脏提取的总RNA经RT得到CRT的cDNA第一链，随后通过PCR获得CRT的编码DNA片段，其片段大小与预期一致(图1)。将回收的PCR片段构建到原核表达质粒pET-15b中，测序后进行对比分析发现，CRT编码框架对接正确，没有碱基突变，说明重组质粒构建成功。利用生物学软件对KM小鼠CRT进行进化树分析，发现相对于其他品系的小鼠其具有很高的同源性，例如：相对于BALB/C 小鼠其序列的同源性可达到99.6%(GenBank accession no. X14926)，相对于人的CRT序列(GenBank accession no. NM004343)同样也达到了88.0%左右(图2)。

注：M：1 000 bp的DNA分子质量标记； 1：PCR产物 图1 CRT的PCR产物凝胶电泳图

图2 KM小鼠CRT序列的进化树示意图

2.2 重组蛋白CRT的表达条件的优化

同样将上述测序正确的菌液转接于3 mL氨苄抗性的培养基中37℃培养至OD600为0.6～0.8之间时转入30℃摇床培养，分别收集4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h和28 h时间点的菌液于离心管内，5 000 rpm，5min离心收集菌体，裂解后经聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。

注：A：诱导时间6 h； B：诱导时间12 h； (M：蛋白分子质量标记；1-4：28℃温度下IPTG的终浓度0 mM，0.1 mM，0.5 mM，1.0 mM；5-8：37℃温度下IPTG的终浓度0 mM，0.1 mM，0.5 mM，1.0 mM) 图3 SDS-PAGE分析IPTG诱导重组蛋白CRT表达的条件

注：M：蛋白分子质量标记； 1：未诱导； 2-8: 30℃分别诱导4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h 图4 SDS-PAGE分析自诱导重组蛋白CRT的条件

注：M：蛋白分子质量标记； 1：未诱导； 2: 30℃诱导20 h； 3：纯化后的重组蛋白CRT； 4：Western bloting分析自诱导重组蛋白CRT的特异性 图5 SDS-PAGE及Western bloting分析自诱导重组蛋白CRT

2.3 重组蛋白CRT的纯化及Western blot 蛋白印迹验证

将纯化后的重组蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转至纤维素膜上，随后将膜放置5%的脱脂牛奶中室温封闭1.5 h。TBST缓冲液洗涤3次后，将膜放置于CRT多克隆抗体溶液中(1∶250稀释)4℃孵育4 h，TBST缓冲液洗涤3次后，加入含有辣根过氧化物酶的二抗室温孵育50 min，用TBST缓冲液洗涤3次，随后ECL法显影并记录结果。

表1 不同诱导方法诱导重组蛋白CRT的产率

诱导条件总蛋白(mg)重组蛋白CRT(mg)产率(%)30℃自诱导20 h17.628.4648.0137℃ 1.0 mM IPTG诱导6 h15.361.137.36

注：蛋白浓度由BCA蛋白测定试剂盒测定，菌液的总体积为200 mL

3 讨论

CRT作为一种高度保守的Ca2+结合伴侣蛋白，主要存在于ER中。除了维持细胞内Ca2+平衡，负责糖蛋白的折叠，参与线粒体代谢等生物活动外，还可引起肿瘤细胞免疫原性凋亡。这是由于前凋亡的肿瘤细胞可引起内质网应激，进而导致肿瘤细胞内CRT的外翻。外翻后出现在细胞膜上的CRT可作为吞噬信号有效增强抗原递呈细胞对肿瘤细胞的识别与吞噬。由此引发抗同种肿瘤细胞的免疫杀伤效应，诱导肿瘤免疫原性细胞进入凋亡程序。鉴于CRT在肿瘤免疫治疗中的潜在应用价值，需要对其进行深入研究，以助于探索新的肿瘤免疫治疗途径。遗憾的是，CRT在大多数表达系统中表达量较低，而基础和临床研究均需要大量的CRT，因此需要优化一种可以大量表达CRT的方法。

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相对其他的诱导系统，T7诱导表达系统在蛋白表达中应用更为广泛。为了优化重组蛋白CRT的表达量问题，我们前期利用原核表达质粒pET-15b、pET-28a及pET-32a构建重组质粒来进行诱导表达的优化。然而，无论是优化诱导时间、温度或IPTG的浓度都无法获得较高产量。这可能是由于重组蛋白CRT对宿主细胞存在着一定的细胞毒性[14-16]，在IPTG存在时E.Coli有一定的自身保护机制会抑制重组蛋白CRT的表达。鉴于在培养E. Coli时一般都选用LB培养基，其主要成分中含有胰蛋白胨。胰蛋白胨是酪蛋白经过胰酶消化后的产物，而酪蛋白主要是由牛奶或大豆中提取，其不可避免含有微量的乳糖成分。微量的乳糖避免了IPTG对细胞的毒性且在摇菌晚期可一定程度进行目的蛋白的缓慢诱导，因此可利用这种方法尝试对重组蛋白CRT的缓慢诱导。结果发现在不加IPTG的条件下30℃摇菌20 h时的重组蛋白CRT的表达量明显高于通过IPTG诱导的方式。这也可能是目的蛋白的缓慢诱导表达对宿主细胞的毒害作用较弱，因此可一定程度提高目的蛋白的产量。

综上所述，编码CRT的基因在相同物种间具有高度保守性。可能由于CRT结构构象和某些生物学功能的限制，在IPTG诱导的T7表达系统重组蛋白CRT的表达量并不是十分理想。利用培养基中微量乳糖的无IPTG诱导的方法可以一定程度的提高重组蛋白CRT的表达量且可为CRT的生物研究提供一定量的试验材料。值得注意的是，由于影响重组蛋白原核表达的机制是多方面，其具体机制还需进一步研究。

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