脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是一种危重的脑卒中亚型。在全球范围内脑出血具有很高的发病率、致死率和致残率[1]。目前针灸治疗已经被广泛应用于临床治疗脑出血后的神经功能缺损。临床观察显示，针刺足三里具有促进中风患者神经功能恢复之功效[2]。基础研究也证明，针刺足三里能抑制脑出血后神经细胞凋亡，促进神经功能恢复[3，4]。

血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)-1和-2是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)特异性受体，VEGF通过与VEGFR-1和-2的结合，启动微血管新生中的初始过程，并最终形成成熟的血管结构[5]。研究显示：脑出血后VEGF及其受体VEGFR-1和-2表达明显上调[6]，且针刺足三里能通过上调VEGF的表达而促进脑出血后的血管新生过程[7]。为进一步研究针刺足三里对促进脑出血后血管新生的作用机制，本实验选用针刺足三里干预大鼠脑出血模型，观察针刺足三里对脑出血脑内VEGFR-1和-2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性Sprague-Dawley大鼠72只，3月龄，体重180～220 g，购于中南大学实验动物学部[许可证号：SDXK(湘)2006-0002]。饲养于中南大学实验动物学部，动物自由进食进水。动物房7：00-19：00光暗交替，相对湿度55%，温度22℃。动物适应环境1周后开始实验。将大鼠随机分为脑出血组、针刺组和假针刺组，每组24只。

1.2 试剂

Ⅶ型胶原酶(Sigma公司)，Trizol(MRC公司)，逆转录试剂盒，Taq DNA聚合酶，dNTPmix(均为美国Fermentas公司)，小鼠抗大鼠VEGFR-1、VEGFR-2单克隆抗体(Santa Cruz公司)，ABC试剂盒(Vector公司)。

在“串联式”实践教学活动实施前后,我们进行了评判性思维倾向的调查.调查量表采用中文版本的评判性思维倾向性测量表(CTDI．CV)[4],有 7方面的特质：寻找真相、开放思想、分析能力、系统化能力、评判性思维的自信心、求知欲和认知成熟度.将实践教学活动实施前后的调查数据采用SPSS15.0软件包进行统计，前后两组数据采用配对t检验进行分析.

1.3 主要仪器

以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后将大鼠取俯卧位并固定于鼠脑立体定位仪，按无菌操作原则，将0.5U Ⅶ型胶原酶立体定向注入苍白球(定位前囟后1.4 mm，旁开3.2 mm，深5.6 mm)[8]。

1.4 脑出血动物复制

StoelTing TL-2鼠脑定位仪(美国)，TC-512型PCR仪(英国Techne公司)，荧光定量PCR仪(德国Roche Diagnostics)，罗氏毛细硅管(德国Roche)，低温高速离心机(美国Sigma公司)。

1.5 针刺干预

参照实验动物穴位图谱(由中国针灸学会实验针灸委员会制定)，选取双侧“足三里”为针刺穴位(定位于大鼠后肢膝关节下方腓骨小头内侧5 mm)，使用华佗牌针具(0.3 mm×25 mm)，平刺5～7 mm，应用G6805-2型电针仪(上海医疗器械高技术公司)，电流强度2 mA，以局部皮肤肌肉轻微颤抖为度，每次电针时间为20 min，1次/d，疏～密波，频率2～15 Hz。假针刺组以同样的方法针刺双侧非经非穴处皮肤(足三里外侧旁开5 mm)。

1.6 免疫组织化学(ABC法)检测VEGFR-1和-2的时空分布

本实验用免疫组化观察到，脑出血后3 d时损伤区周围可检测到VEGFR-1和-2阳性微血管段，7 d时VEGFR-1和-2阳性微血管段增多，并伸入血肿区，至14 d时血肿区即出现阳性微血管段(见图1)。

采用Trizol方法提取总RNA，紫外分光光度计检测总RNA纯度。按逆转录试剂盒说明书操作，在逆转录酶的作用下，将总RNA逆转录为cDNA，以β-actin为内参行PCR扩增。扩增条件：95℃预变性3 min，95℃ 5 s，60℃ 34 s，76℃ 5 min，共40个循环，生成VEGFR-1和-2的溶解曲线和扩增曲线。根据扩增曲线，对cDNA的含量进行定量分析，2-ΔΔCt法统计分析数据[9]。

1.7 荧光定量RT-PCR组织处理方法

所有数据采用SPSS 12.0软件包进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较用方差分析(ANOVA)。方差齐时，采用LSD检验；方差不齐时，采用Dunnett's T3检验，检验水准α为0.05。

1.8 荧光定量RT-PCR方法检测VEGFR-1和-2 mRNA表达

1.8.1 引物序列

[53][55]Charles B. McLane, Soviet Strategies in Southeast Asia: An Exploration of Eastern Policy under Lenin and Stalin, Princeton: Princeton University Press, 1966, pp. VII- VIII, VII.

1.8.2 提取总RNA

林丹的车行在高速路上，方晓倩的短信就到了，说她准备好了他爱吃的西红柿牛腩。他回信息:“还准备了什么?”“我。”

伴随企业的发展，在企业集团战略性成本管理创设中，应该将成本企划作为企业集团的重点，按照企业经营领域以及产品方向定位，进行产品成本管理方案的设计，提升企业运行的价值性。在企业成本企划的过程中，其作为一种现代性的成本管理方案，可以对企业新产品的发展进行规划，结合战略性的发展目标，进行成本管理制度的创新，为企业成本管理理念的确定提供支持。而且，在企业成本企划中，相关人员应该结合预期销售的内容，确定期望利润，明确目标的成本，并根据这些内容进行产品工艺流程、流通加工以及包装成本等问题的确定，展现企业集团成本企划工作的价值性[3]。

1.9 统计学方法

各组分别于术后3、7、14 d处死动物，分离出以苍白球(血肿)为中心的脑髓质约100 mg并置于冻存管，浸入液氮后，-80℃保存备用。

引物由上海英骏生物工程公司合成纯化，具体的引物序列如下：VEGFR-1:F:5′-TACCCGCAACGGAGAA-3′, R: 5′-GGCTTGGAAGGGACGA-3′；VEGFR-2:F:5′-AACGCTTGCCTTATGAT-3′,R:5′-AAGTCGCTGTCTTGTCG-3′；β-actin:F:5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3′,R:5′-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。

2 结果

2.1 VEGFR-1和-2在脑出血组不同时间点的表达位置变化

注：脑出血后3 d在血肿周围可检测到VEGFR-1和-2的阳性微血管段，7 d后VEGFR-1和-2阳性微血管段逐渐伸入血肿区，且开始出现分枝，至14 d血肿区出现阳性血管段(黑色箭头所指为阳性微血管段，比例尺100 μm，DAB染色) 图1 脑出血后VEGFR-1和-2的表达位置变化

注：脑出血组与前一时间点比较：*P<0.05，**P<0.01；与脑出血组同时间点比较：◇P<0.05，◇◇P<0.01 图2 针刺后VEGFR-1和-2 mRNA表达变化

术后3、7、14 d随机抽取大鼠3只，10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，打开胸腔,暴露心脏，经升主动脉先以恒温37℃生理盐水冲洗，再以4℃的多聚甲醛(0.1mol/L PBS配制，pH 7.4)灌注(10 mL/min)固定后分离取脑，随后脑组织置于4℃的多聚甲醛中后固定4 h后，依次置于梯度蔗糖溶液(10%，20%，30%，0.1 mol/L PBS配制，pH 7.4)至沉底以脱水。采用Leica1850冰冻切片机行连续冠状切片，厚度30 μm，4℃冰箱保存备用。采用SABC法进行VEGFR-1和或VEGFR-2染色，1% BSA代替一抗作阴性对照。冰冻切片于37℃复温后，采用0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，随后用3% H2O2阻断内源性的过氧化酶。PBS漂洗后，以5%小牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗(小鼠抗大鼠VEGFR-1或VEGFR-2单克隆抗体，浓度均为1∶200)37℃孵育1 h，4℃冰箱过夜。滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG(1∶100)和ABC复合物(1∶100)37℃孵育各1 h，DAB显色。

2.2 针刺足三里对脑出血后VEGFR-1和-2 mRNA表达的影响

为评价针刺足三里对脑出血大鼠脑内VEGFR-1和-2 mRNA表达的影响，本实验采用荧光定量PCR检测其在各组不同时间点的表达变化。结果显示：脑出血后VEGFR-1和-2 mRNA表达丰度逐渐增加，且一直持续到14 d(P<0.05)。VEGFR-1和-2 mRNA在针刺组的表达水平均明显高于同时间点二者在脑出血组中的表达(P<0.05)，而同时间点VEGFR-1和-2 mRNA在假针刺组中的表达与脑出血组比较，差异无统计学意义(见图2)。

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3 讨论

VEGFR-1和-2是VEGF的2个特异性酪氨酸激酶受体，主要表达于血管内皮细胞。在血管新生过程中，VEGF通过与VEGFR-1和-2结合从而促使血管内皮细胞出芽，形成新生血管；VEGFR-1主要介导细胞骨架重排引起细胞迁移,调控细胞的适度增殖和有组织地组合。而VEGFR-2在VEGFR-1的协调下发挥主导受体的作用,是决定内皮细胞有丝分裂和增殖的关键因素[10-12]。

既往研究发现，脑缺血后VEGFR-1和-2表达上调，参与调节脑缺血后血管新生，有利于神经功能恢复[13]。与脑缺血研究结果相似，本实验结果显示脑出血后VEGFR-1和-2表达逐渐增加，提示VEGFR-1和-2可能通过调节内皮细胞增殖、迁移和重组，从而参与脑出血后血管新生过程的调控。由于VEGFR-1和-2的表达受多种因子的调控，包括缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)、VEGF以及炎症因子，如肿瘤坏死因子-1α(tumor necrosis factor-1α, TNF-1α)。HIF-1α和VEGF可以促进VEGFR-1和-2表达[14，15]，而TNF-1α则抑制VEGFR-1和-2的表达[16]。研究证实脑出血后HIF-1α、VEGF和TNF-α表达明显升高[3，17-19]，脑出血早期HIF-1α、VEGF和TNF-1α共同参与调节VEGFR-1和-2的表达，而脑出血后期，VEGF表达逐渐增强，TNF-1α的表达逐渐降低，因此本实验中VEGFR-1和-2的表达随着时间延长逐渐升高。

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脑出血属于祖国医学“中风”范畴，其病理以风、火、痰、瘀、虚为特征,病机多为本虚标实。足三里为足阳明胃经之合穴，具有调和气血、健脾和胃、通经活络、扶正培元之功效。临床观察显示，针刺足三里能明显改善脑出血患者的神经功能缺损[2]。同时动物实验也证实针刺足三里能上调VEGF在脑缺血和脑出血大鼠脑内的表达[7，20]。本实验在采用针刺足三里干预后，VEGFR-1和-2的表达较脑出血明显升高，提示针刺足三里可能通过上调VEGFR-1和-2的表达，促进血管内皮细胞出芽和增殖，从而有利于损伤组织功能的修复。究其机制可能与以下两个方面有关：(1)针刺足三里可通过促进VEGF的表达而诱导VEGFR-1和-2的表达上调[7，20]；(2)针刺足三里能抑制TNF-α的表达，使VEGFR-1和-2受抑制程度降低，从而反馈性的上调VEGFR-1和-2的表达[21，22]。

综上所述，本实验结果证明针刺足三里能显著上调脑出血VEGFR-1和-2的表达，从而促进了损伤区血管新生过程。

参考文献：

[1] Liu L, Wang D, Wong K S, et al． Stroke and stroke care in China: huge burden, significant workload, and a national priority[J]． Stroke, 2011, 42(12): 3651-3654．

[2] Ko C N, Lee I W, Cho S Y, et al. Acupuncture for cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage: a retrospective case-control study[J]． J Altern Complem Med, 2013, 19(5):471-473．

[3] Cho N H, Lee J D, Cheong B S, et al. Acupuncture suppresses intrastriatal hemorrhage-induced apoptotic neuronal cell death in rats[J]． Neurosci Lett, 2004, 362(2):141-145．

[4] Yang Y J, Kim Y S, Shin M S, et al. Effects of acupuncture on the intrastriatal hemorrhage-induced caspase3 expression and newly cell birth in rats[J]． Neurol Res, 2007, 29 (Suppl 1):S65-71．

[5] Shibuya M. VEGF-VEGFR signals in health and disease[J]． Biomol Ther (Seoul), 2014, 22(1):1-9．

[6] Tang T, Liu X J, Zhang Z Q, et al. Cerebral angiogenesis after collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]． Brain Res, 2007, 1175(1):134-142．

[7] 吴 婧, 唐 涛, 周华军, 等. 电针对脑出血大鼠血管内皮生长因子mRNA表达的影响[J]． 2010, 7(19): 1172-1174．

[8] Rosenberg G A, Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]． Stroke, 1990, 21(5): 801-807．

[9] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method[J]． Methods, 2001, 25(4):402-408．

[10] Carmeliet P, Collen D. Molecular analysis of blood formation and disease[J]． Am J Physiol, 1997, 273(5Pt2):H2091-2104．

[11] Risau W. Mechanisms of angiogenesis[J]． Nature, 1997, 386 (6626): 671- 6741．

[12] Zeng H, Zhao D, Yang S, et al. Heterotrimeric G alpha q/G alpha 11 proteins function upstream of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-2 (KDR) phosphorylation in vascular permeability factor/VEGF signaling[J]． J Biol Chem, 2003, 278(23): 20738-20745．

[13] Greenberg D A, Jin K. Vascular endothelial growth factors (VEGFs) and stroke[J]． Cell Mol Life Sci, 2013, 70(10): 1753-1761．

[14] Nevo O, Soleymanlou N, Wu Y, et al. Increased expression of sFlt-1 in in vivo and in vitro models of human placental hypoxia is mediated by HIF-1[J]． Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2006, 291(4):R1085-1093．

[15] Okuyama H, Krishnamachary B, Zhou Y F, et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 in bone marrow-derived mesenchymal cells is dependent on hypoxia-inducible factor 1[J]． J Biol Chem,2006,281(22):15554-15563．

[16] Altorjay I, Vereb Z, Serfozo Z, et al. Anti-TNF-alpha antibody (infliximab) therapy supports the recovery of eNOS and VEGFR2 protein expression in endothelial cells[J]． Int J Immunopathol Pharmacol, 2011, 24(2):323-335．

[17] Zhou H J, Tang T, Cui H J, et al. Thrombin-triggered angiogenesis in rat brains following experimental intracerebral hemorrhage[J]． J Neurosurg, 2012, 117(5):920-928．

[18] Prunell G F, Svendgaard N A, Alkass K, et al. Inflammation in the brain after experimental subarachnoid hemorrhage[J]． Neurosurgery, 2005, 56(5):1082-1092．

[19] Xi G, Keep R F, Hoff J T. Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage[J]． Lancet Neurol, 2006,5(1):53-63．

[20] 毛庆菊, 陈邦国. 电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮层微血管超微结构及血管内皮生长因子表达的影响[J]．针刺研究, 2012, 37(6):476-481．

[21] 陈素辉, 孙 华, 徐 虹, 等. 针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠双侧脑组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达的影响[J]． 2012, 37(6):470-475．

[22] Xu H, Sun H, Chen S H, et al. Effects of acupuncture at Baihui (DU20) and Zusanli (ST36) on the expression of heat shock protein 70 and tumor necrosis factor α in the peripheral serum of cerebral ischemia-reperfusion-injured rats[J]． Chin J Integr Med, 2014, 20(5): 369-374．