骨传导是同种异体骨的重要功能，即同种异体骨植入受体骨缺损区后，受体的破骨细胞、成骨细胞、毛细血管等细胞和组织可长入其三维孔隙中，爬形替代后形成新骨[1-2]。然而，当前骨移植所使用的同种异体骨的骨传导能力不强，在受体内难以产生较多的新骨，并且长期不能被吸收，不能完全满足临床的需要[3]。究其原因，是因为其微孔表面对细胞的亲和力不强，宿主的细胞难以在其表面贴附、增殖、分化，毛细血管等组织难以长入[4]。本研究就同种异体骨经多聚赖氨酸表面改性后，其在体内、体外的骨传导能力的变化作一探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 20只新西兰大白兔(南京清龙山实验动物中心)；兔同种异体骨(第四军医大学西京骨科医院骨库)；左旋多聚赖氨酸(相对分子质量为150 000～300 000，Sigma，美国)；DMEM培养基、D-Hank′s液、转化生长因子-β2(TGF-β2)(Gibico，美国)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；戊巴比妥(军事医学科学院)；胰蛋白酶、地塞米松、L-抗坏血酸(Sigma，美国)；ITS(其中含有牛胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠，Sigma，美国)；丙酮酸钠、ALP活性测定试剂盒(上海化学试剂集团)；β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)；50 mL一次性塑料培养瓶、6孔培养板(Coster，美国)；CO2恒温培养箱(Hereus，德国)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；倒置相差显微镜(Zeiss，德国)；扫描电子显微镜(Hitachi，日本)；冷冻干燥机(Alpha 2-4 Chaist,德国)；酶联免疫检测仪(Sunrise,瑞士)；螺旋CT(Siemens,德国)。

1.2 方法

咨询公司的做法确有不妥。从您的介绍来看，若您所述属实，那么根据《企业职工带薪年休假实施办法》中第三条“职工连续工作满12个月以上的，享受带薪年休假”的规定，您今年可以享受带薪年休假。但现在的问题是：您得证明自己已连续工作1年以上。

1.2.1 兔同种异体骨的表面改性 将取自兔椎体松质骨的同种异体骨切割成边长为3 mm的立方体，然后于3%的多聚赖氨酸溶液内振荡2 h，使溶液充分浸透同种异体骨的微孔表面。取出置于6孔培养板内，-20 ℃下预冷2 h，-80 ℃下冷冻1 h，转移至冷冻干燥机中干燥24 h。20 kGy Co 60辐照灭菌，4 ℃条件下密封保存。

围墙外面的“我”被这冷不丁的“老爷”重重地刺伤，心里滴血。这声老爷就像一盆冷水，浇灭了“我”积蓄二十年的热情；这声老爷就像深冬刺骨的风，扎得“我”浑身疼痛；这声老爷就像一道鸿沟，隔开了曾经兄弟情谊的“我”和他。

1.2.6 测定2组同种异体骨内黏附细胞所表达的碱性磷酸酶(ALP)的活性 于培养、诱导第3、6、9和12天，每次2组分别随机取出8个标本。D-Hank′s液漂洗后，依次添加ALP活性测定试剂盒内试剂。使用酶标仪在520 nm波长处测定A值，代表细胞ALP的活性。

当前GPON/XG(S)-PON技术存在上行转发时延过长的问题，主要原因是：PON数据依照125 us周期进行传输，一般DBA调度在4个周期左右。考虑到数据包分片，如果不做特殊处理，上行时延将达到1 ms，这样不能满足5G回传对接入段最低数百微秒的时延要求。同时，ONU开窗发现需要PON下面所有ONU在较长时间内停止数据传输，导致时延达到数个毫秒以上，从而使得时延和抖动更加恶劣。NG-PON技术将在数据转发延迟和ONU开窗发现这2个方面做深入优化，满足5G回传的要求。

我们先后两次遭遇暴雨，恰好都是在重点景区；一次是阿斯哈图石阵区，一次是在达里湖区。石阵景区的那场暴雨是眼看着压顶而来的，西天的云相一直在阳光的强照射中厚积和酝酿，云光银亮暴闪，但突然就变得黑压压起来。铁砧状的“暴雨云”在东蒙草原可以长势奇快，从所有看不见的角度里蜂拥而出，密云厚卷、云上有云、云底似墨，一副空中地狱般的恐怖天相。大地上所有的花草树木在狂云的遮压下反而显得明亮起来，而当云势在头顶上进一步低压逼迫，直似举手可触的时候，携雨带风的云就全都变成了瓢泼而下的雨，天连地接，一片苍茫，其气势之猛烈，似乎远非柳宗元“惊风乱飐、密雨斜侵”诗词名句所能描绘了。

1.2.8 2组桡骨缺损处新生骨螺旋CT扫描 于术后1、2、3和4个月分次取材，每次处死5只兔。将尺桡骨做好分组标记，以4%多聚甲醛固定3 d，然后将标本置于螺旋CT内进行扫描。扫描完成后，以桡骨缺损修复区为中心，选取直径2 cm、高度5 cm的圆柱形区域作为兴趣区(region of interest,ROI)，进行精细三维重建，并观察三维重建影像。

采用分层整群抽样，于2014年3—10月针对新疆维吾尔自治区高等院校、职业院校的男护生展开调查，包括新疆医科大学护理学院、石河子大学护理学院、现代职业技术学院、阿克苏职业卫校、塔城卫校、喀什卫校等。其中汉族男生138名，维吾尔族112名，回族11名，哈萨克族6名，其他民族8名；中专生75名，大专生115名，本科生85名。

1.2.2 兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的分离和扩增 麻醉、消毒后，持20 mL无菌注射器从2.5 kg新西兰大白兔的一侧股骨大粗隆处抽取0.5 mL骨髓，置于低糖DMEM培养基(10%胎牛血清)的50 mL培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。以全骨髓贴壁法提纯BMSCs，3 d后进行首次全量换液，去除未贴壁的细胞。此后每2～3 d半量换液1次，待细胞达80%～90%融合时消化传代。

1.2.7 2组同种异体骨植入兔桡骨骨缺损处 距离上次抽取骨髓约5周左右，兔再次被麻醉。消毒、铺无菌巾后，于双侧前臂桡侧中段作一长约1.5 cm的纵切口，逐层切开皮肤、皮下组织、深筋膜，钝性分离肌肉，显露桡骨中段。钝性分离并保留骨膜，剪除1 cm长桡骨干。仔细检查细胞与兔编号，将结合自体向成骨细胞诱导的BMSCs的实验组同种异体骨回植于左侧桡骨缺损处，对照组回植于右侧。逐层缝合深筋膜、皮肤，术毕。实验兔清醒后，笼内自由活动。20只兔的40个桡骨被平均分在实验组与对照组中。

1.2.4 扫描电镜(SEM)观察细胞在同种异体骨内黏附和增殖的情况 于培养的第 3、9和15天，每次2组各自随机取出2个标本。经2.5%的戊二醛、1%锇酸先后固定，利用乙醇依次梯度脱水，接着使用乙腈依次置换出乙醇，然后在真空内干燥。在同种异体骨与细胞表面喷金后，放置于SEM内，观察细胞在同种异体骨微孔表面贴附与增殖情况。

1.2.5 检测2组同种异体骨内细胞增殖的情况 于培养、诱导的第3、5、7、9、11、13、15和17天，每次2组各自随机取出10个标本，PBS液分别轻柔漂洗3遍，以清除同种异体骨内未贴附的细胞。然后，采用MTT法检测BMSCs增殖的情况。以时间为横轴、吸光度(A)值为纵轴，绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学方法 采用t检验。

2 结果

2.1 BMSCs在2组同种异体骨微孔表面的贴附、增殖情况的SEM观察 在BMSCs种植于2组同种异体骨微孔表面并培养的第3、9和15天，使用SEM观察BMSCs在微孔表面贴附、增殖情况(见图1)。培养后的第3天，细胞已完全平铺，同时伸出长长伪足附着在微孔表面，实验组同种异体骨微孔表面的细胞数目明显大于对照组(见图1 A、D)；培养后的第9天，2组细胞数量均增多，而实验组增加更明显(见图1B、E)；培养后的第15天，实验组细胞之间发生接触抑制，数量难以增加，近于铺整个满微孔表面，而对照组的细胞数量显著少于实验组(见图1C、F)。

2.2 BMSCs在2组同种异体骨微孔表面增殖情况 根据MTT实验结果绘制的细胞生长曲线显示：从诱导、培养的第3天至第17天，BMSCs在2组同种异体骨微孔表面的数量均持续上升，至第11天左右时增殖速度减缓，第15天左右时进入平台期，生长曲线呈抛物线样。BMSCs在实验组同种异体骨内增殖迅速，细胞数量较多。而对照组的BMSCs增殖缓慢，在每个时间点上的数量均明显少于对照组，2组差异有统计学意义(P<0.01)(见图2)。

表1 2组同种异体骨微孔表面的BMSCs增殖情况

分组n3d5d7d9d11d13d15d17d实验组80．138±0．0620．229±0．0400．289±0．0360．329±0．0460．371±0．0540．387±0．0460．397±0．0400．399±0．032对照组80．035±0．0200．072±0．0230．104±0．0470．132±0．0380．159±0．0430．175±0．0490．192±0．0570．195±0．062t—4．489．624．674．113．784．314．515．26P—<0．01<0．01<0．01<0．01<0．01<0．01<0．01<0．01

2.4 2组桡骨缺损处新生骨螺旋CT扫描结果 于术后1、2、3和4个月，对2组桡骨缺损处新生骨进行螺旋CT扫描并三维重建(见图2)。术后1个月，实验组桡骨缺损处所植入的同种异体骨有轻度的吸收，并有少许新骨形成(见图3A)；而对照组的同种异体骨被吸收的较多(见图2E)。术后2个月，2组桡骨缺损处所植入的同种异体骨均被大部分吸收，实验组有较多的新生骨形成，基本上填充了骨缺损区，而对照组无明显的新生骨形成(见图2B、F)。术后3个月，2组同种异体骨均完全被吸收，实验组形成了骨痂将两骨折断端相连(见图2C)；而对照组骨缺损区仍呈骨缺损状(见图2G)。术后4个月，2组同种异体骨被完全吸收，实验组骨痂塑形改造，完全修复了骨缺损区(见图2D)；而对照组骨缺损区无修复迹象，呈骨不连的表现(见图2H)。

表2 BMSCs在微孔表面培养与诱导后，表达的ALP活性比较

分组n3d6d9d12d实验组80．0836±0．00520．1162±0．03350．3809±0．00370．4174±0．0410对照组80．0691±0．00310．1017±0．07440．1504±0．00520．1636±0．0294t—6．770．5055．796．00P—<0．01﹥0．05<0．01<0．01

2.3 BMSCs在2组同种异体骨内培养与诱导后所表达的ALP活性的比较 BMSCs所表达的ALP活性的结果表明：2组细胞经过成骨诱导液培养后，所表达的ALP的活性逐渐增加。实验组在第6天时ALP活性值与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；而在第3、9、12天时，实验组的ALP活性值均明显高于对照组(P<0.01)(见表2)。

1.2.3 BMSCs种植于同种异体骨内并进行诱导、培养 将第3代BMSCs置于成骨培养基(含10-8 mol/L地塞米松、50 mg/L L-抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和10%胎牛血清的高糖DMEM)内，制成密度为1×107个/mL的细胞悬液。将BMSCs悬液接种在同种异体骨内，最终控制接种的细胞数量为2×104个/块左右。然后置于细胞培养箱中孵育4 h，再添加成骨培养基，此后每2～3 d半量换液1次。

3 讨论

组织工程骨支架是受体细胞生长与增殖的载体，细胞通过静电吸引、分子间范德华力、阴阳离子交联等方式，在支架材料的微孔表面进行黏附，进而扩增与分化。对支架材料进行表面改性，以增强其对细胞的亲和力，是提高骨组织工程支架的骨传导性的主要手段之一，有学者[5-7]使用诸多方法在若干动物实验中获得了一定的成功。然而，目前临床上所使用的同种异体骨均未经过表面改性，骨传导性不强，在许多病例中难以完成受体骨缺损区修复的任务[8]。因此，对同种异体骨进行表面改性具有十分重要的意义。

细胞实验中所使用的细胞培养瓶(板)、玻片的表面，均经过涂抹多聚赖氨酸的处理，能大大提高其对细胞的亲和力[9-11]。受此启发，为提升同种异体骨的骨传导性，本实验采用冻干法将多聚赖氨酸均匀地覆盖在同种异体骨微孔表面，以对其进行表面改性，目的是在微孔表面构建一个有利于细胞附着的局部微环境，从而有利于细胞的增殖与分化。

无人船融合了通讯、算法、测控，自动化、网络化系统等综合平台技术，具有自主导航、自动避障、等性能特点，可搭载多种测量或探测设备环境监测等自动化作业，通过无人船水文监测后，可以获取完备的水质参数分布图，对于污染的分布,实现在水文监测领域的新突破，具备自主导航和自动避障，并可以对河涌水质进行移动式在线连续多参数多点监测。本研究的创新点：

本研究中，SEM观察和MTT实验检测2组细胞的结果显示：BMSCs在接受了多聚赖氨酸表面改性的实验组同种异体骨微孔表面上贴附、增殖的数量明显多于对照组；ALP活性测定试剂盒检测结果显示，诱导、培养9 d后，实验组BMSCs所表达的ALP活性明显高于对照组；2组桡骨缺损处新生骨的螺旋CT三维重建结果表明，实验组桡骨缺损处的修复情况明显优于对照组。提示使用多聚赖氨酸对同种异体骨表面改性，能大大促进BMSCs在其微孔表面进行黏附、增殖和分化，显著提升其骨传导性。

多聚赖氨酸对同种异体骨进行表面改性的作用机制，分析可能是以下几点：(1)其残基所带的多种阳离子，与细胞表面的部分阴离子发生交联作用，可利于细胞在其表面的黏附[12]；(2)多聚赖氨酸覆盖在同种异体骨微孔表面后，使微孔表面呈正电荷状态，能通过静电吸引的作用，促进细胞在微孔表面黏附[13]；(3)多聚赖氨酸所具有胺基、羟基等，能吸附血清中层黏蛋白、糖胺聚糖和纤维黏连蛋白等，可增强异体骨微孔表面的亲水性，从而利于细胞的黏附[14-15]；(4)多聚赖氨酸能稳定细胞外基质，促进细胞的生长和分化[16-17]。

本研究中，未发现有明显的细胞凋亡现象；在动物体内实验中，未发现有动物死亡以及其他并发症出现，提示经多聚赖氨酸表面改性后的同种异体骨植入受体后，对受体的细胞与机体无害。此外，此表面改性的方法与步骤较简单，成本低廉，大多数科研院所均可操作。本研究证明，使用多聚赖氨酸对同种异体骨进行表面改性后，同种异体骨的骨传导性能够得到显著提升，为提高同种异体骨治疗骨缺损的效果提供了坚实的理论与实验基础。

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