骨关节炎症和缺损在临床上很常见，病理改变是不可逆的。骨关节炎(OA)发病病因很多，可能与年龄、肥胖、机械压力以及关节创伤史有关[1]。关节软骨缺少血管、淋巴管及神经，其损伤后的再生能力有限[2]。细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)是软骨细胞存活的必要条件，其可以结合许多因子调节细胞功能。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-3和MMP-9是MMPs家族中的重要成员，对ECM的主要作用是降解软骨细胞[3]。MMPs家族中的胶原酶3(MMP-13)是引起ECM降解作用最显著的因素之一[4]。在软骨修复过程中，降解和吸收加快，造成生成不足而失衡，这也是关节软骨缺损后难以修复的一个重要因素[5]。本研究通过实时PCR手段观察MMPs在细胞损伤后表达变化，探讨MMPs与关节软骨损伤和修复的关系。现作报道。

曾经有人指出，课堂教学是一个向着未知方向不断深入的探索历程，意外而美丽的风景随时都可能出现在路边，因此我们的教学不能循着固定的路径来进行，否则课堂将缺乏意外的生成，也就无法激起学生创造的热情.所以，教师应该意识到高中化学的教学不应该是一个预约的过程，而应该是一个学生与教师、学生与教材碰撞和沟通的过程，只有将这一思想贯彻在化学教学中，学生才能看到那些意外而美丽的风景.

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级4周龄新西兰大白兔，雌雄不限，由蚌埠医学院实验动物中心提供。

1.2 试剂 DMEM/F12培养基、胰蛋白酶 (Hyclone公司)；Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)；胎牛血清(四季青购于北京中杉公司)；双抗(青霉素、链霉素，北京中杉公司)；甲苯胺蓝(Sigma公司)；兔抗人Ⅱ型胶原抗体、FITC标记山羊抗兔IgG(上海生物工程公司)；Hoechst 33258核染料(碧云天公司)；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、PCR试剂盒(Fermentas公司)；PBS液、5×TBE、10×TBE、溴酚蓝(上海生工生物工程有限公司)；RNA Loading Buffer×6、DNA Loading Buffer×6、Marker(100-600 bp、100-1200 bp )(Biosharp公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；溴化乙锭(EB，凯基生工生物有限公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC)水(加拿大BBI公司)；琼脂糖(西班牙BIOWEST公司)；EvaGreen Master Mix(上海超世生物有限公司)。

11月16日，由科技部基础司、成果与区域创新司、国家科技基础条件平台中心指导，贵州省科技厅、贵安新区管委会主办的第三届长江经济带科技资源共享论坛在贵安新区东盟国际会议中心举行，长江经济带沿线11省（市）及部分特邀省（市）科技部门、科研院所、高校和企业相关人员300余人参会。

2.3 不同时间点MMPs的mRNA表达变化 在软骨细胞损伤后的不同时间点，MMP-2、MMP-3和MMP-9的mRNA表达呈现不同的表达规律。MMP-2 mRNA损伤后1 d上升，3 d下降，7 d上升到最高。MMP-2 mRNA损伤后1、3、7 d组较正常组表达升高，差异有统计学意义(P<0.05～P<0.01)。MMP-3 mRNA在损伤后1 d开始降低，7 d最低，正常组和损伤后相比呈下降趋势(P<0.01)。MMP-3 mRNA损伤后1、3、7 d组与正常组相比表达均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。MMP-9 mRNA损伤后1 d和3 d呈上升趋势，3 d达最高水平，7 d呈下降趋势。损伤后7 d较损伤后1 d组表达升高，差异有统计学意义(P<0.01) (见表2)。

待软骨细胞生长达90%汇合可进行传代，倒掉培养液，含双抗无菌PBS液清洗2遍，向培养瓶中加入 3 mL 0.25%胰酶进行消化，培养箱中5 min，软骨细胞回缩漂浮，加入含15%胎牛血清的培养基终止消化。离心，弃上清，加5 mL含15%胎牛血清的培养基吹打，于6孔板或培养瓶继续培养(细胞浓度1×105)。

在PCR反应管中加入SYBR(Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ROX Reference Dye 1 0.5 μL，模板cDNA 1 μL，DEPC水6.5 μL，反应总体积为20 μL)。反应条件预变性：95 ℃，5 min；变性：95 ℃，15 s；退火：60 ℃，30 s；40个循环，在退火阶段收集荧光信号。用Mastercycler realplex软件分析所获得每个样本各个基因的循环阈值(Ct值)。

施工管理工作往往多以施工进度、施工材料、施工人员、现场安全等方面的管理工作为主，涉及到的内容众多且繁杂，需要相关管理人员必须具备良好的职业素养与专业知识，贯彻与落实好现场施工管理责任，最大限度地确保现场施工安全。立足于当前现状来看，我国电网改造事业虽然得到全面发展，但是在实际发展过程中，配电工程存在的现场管理问题逐渐显现出来，比较影响现场施工质量安全[2]。

2.1 软骨细胞培养及荧光显色 倒置显微镜下，原代培养的关节软骨细胞呈球形或椭圆形，悬浮于培养液。培养12 h后，少数细胞开始贴壁，1 d后部分细胞贴壁，2 d后细胞开始变形，呈散在多角形，1周左右铺满瓶底，换液后可进行传代。荧光显微镜下观察Ⅱ型胶原免疫荧光显色与Hoechst 33258核染色，软骨细胞的细胞质可见绿色光斑，胞核蓝色荧光。

1.6 实时荧光定量PCR检测关节软骨细胞损伤后MMPs mRNA的表达 分别收集正常组和损伤组(1、3、7 d)各6或8孔细胞样本，使用RNA isolaterTM Total RNA Extraction Reagent(Biosharp公司)试剂提取细胞总RNA，按说明书操作，分光光度计测细胞总RNA的OD值和浓度，计算总RNA的体积，根据核酸测定方法。测量方法：加入DEPC水处理比色杯，待晾干后按照1 μL RNA溶液加49 μL DEPC水的比例加入。OD值为1.8～2.0，<1.8说明RNA降解，>2.0说明RNA有杂质不纯，有污染。总RNA电泳，配置1%的琼脂糖凝胶，0.25 g琼脂糖，25 mL 1×TBE，7 μL EB，分别加样本5 μL与2 μL 6×RNA上样缓冲液混匀，电泳30 min凝胶成像仪下拍照保存。若只有一条带可能是RNA污染，2条带说明RNA质量好，3条带说明RNA降解。按照First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书，将每个样本的总RNA逆转录成第一链cDNA。使用Primer 5.0软件设计基因MMP-2、MMP-3和MMP-9实时荧光定量PCR引物(见表1)。

GTD是Getting Things Done的缩写，戴维·艾伦（David Allen）通过Getting Things Done这本书介绍了一种时间管理方式，得到了世人的关注和使用。GTD时间管理方式的核心理念概括就是记录下来要做的事，然后整理安排，去努力执行，每日或每周回顾一次，重新做出调整计划。GTD方法的主要任务是在有限时间内,使用人用有限的精力有效地完成该做的任务，做出最大的单位时间产出。有效的GTD方法，能使繁重、无序的混乱生活变成高效、有序的工作生活方式。

1.4 Ⅱ型胶原免疫荧光显色 将铺满瓶底的软骨细胞制备细胞悬液，滴在涂有多聚赖氨酸的细胞爬片上，待细胞爬片用不含双抗的PBS漂洗后，多聚甲醛固定取爬片行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光显色，显微镜下观察结果并拍照[6]。

2.2 软骨细胞损伤后增殖变化 正常软骨细胞(见图1A)，软骨细胞“井”字形划伤后，划伤区细胞损伤，相邻软骨细胞正常。损伤1 d后，划痕处开始出现极少的新生软骨细胞(见图1B)。损伤3 d后，部分划痕区域出现新生软骨细胞(见图1C)。损伤7 d后，划痕区域几乎被新生细胞所覆盖(见图1D)。

表1 MMP-2、MMP-3和MMP-9实时荧光定量PCR引物信息

基因上游引物(5′⁃3′)下游引物(5′⁃3′)扩增长度/bpMMP⁃2F：5′⁃ATCCACGATGGAGAAGCTGA⁃3′R：5′⁃ACTTCACACGGACCACTTGAC⁃3′190MMP⁃3F：5′⁃AGCGCTGATGTACCCAGTCTA⁃3′R：5′⁃AGAGTGCTGATTGCATCGAAG⁃3′207MMP⁃9F：5′⁃CTGCGAGTTTCCGTTCATCT⁃3′R：5′⁃CGACCACCGTGGAGTCAG⁃3′155GAPDHF：5′⁃TCGTCTCCTGCGACTTCAAC⁃3′R：5′⁃TCGTCCTCCTCTGGTGCTC⁃3′213

2 结果

1.5 兔膝关节软骨体外划伤模型建立 6孔板内细胞生长达90%汇合后，划伤前一天换液，用无菌10 μL枪头，直尺辅助垂直于培养板呈“井”字划伤孔内细胞，划伤时方向、速度和力度一致，而且两划痕平行线之间的距离为0.5 cm，建立关节软骨细胞损伤模型[7-8]。

1.7 统计学方法 采用方差分析及q检验。

1.3 兔膝关节软骨细胞原代培养及传代培养 健康新西兰大白兔，无菌术下取双侧膝关节透明软骨。在培养皿中用无菌含双抗的PBS液清洗3次。眼科剪将其剪碎，15 mL离心管收集，加胰蛋白酶[5]消化1 h，每15 min震荡1次，15%胎牛血清的DMEM/F12培养基(含1%的双抗)终止消化，离心5 min(800 r/min)弃上清。然后再加入Ⅱ型胶原酶消化2 h，每15 min震荡1次，同样终止消化，离心弃上清。再加入无菌不含双抗的PBS液混匀，100目筛网过滤，滤过的液体离心弃上清，加入含15%胎牛血清的培养基3～4 mL吹打移至培养瓶，收集过滤的组织块进行Ⅱ型胶原酶第2次消化，步骤同上，将2次消化的细胞液混合起来，置培养箱中培养(37 ℃恒温、5%的CO2)，2～3 d换1次液。

证明 （1）当时，取满足．由于，因此存在正整数，使得当时，有，即．取满足，由引理2可知，当时，有，即．从而当时，有，即

表2 软骨细胞损伤后不同时间点MMP-2、MMP-3和MMP-9的mRNA表达变化

损伤后时间/dnMMP⁃2MMP⁃3MMP⁃9060．0319±0．00660．0213±0．005100．00005±0．000009 180．0685±0．0194∗∗0．0038±0．00080∗∗0．00059±0．000001∗∗ 380．0493±0．0118∗△0．0003±0．00002∗∗△△0．00232±0．000400∗∗△△ 780．5249±0．0106∗∗△△##0．0002±0．00002∗∗△0．00150±0．000322∗∗△△## F—2478．20126．25152．17P—<0．01<0．01<0．01MS组内—0．0000．0000．000

q检验：与0 d比较*P<0.05，**P<0.01；与1 d比较，△P<0.05，△△P<0.01；与3 d比较##P<0.01

3 讨论

MMPs是蛋白质降解内切酶，具有胶原蛋白活性，与ECM和蝌蚪尾巴的退化过程相关联[9]。MMPs家族成员主要有3个高度保守的结构域[10]。其中，根据底物[11]分胶原酶(如MMP-13)主要作用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，MMP-13降解作用最显著；基质溶解酶(如MMP-3)能降解蛋白多糖及各种基质蛋白；明胶酶(如MMP-9)主要以Ⅳ、Ⅴ型胶原和弹性纤维为底物。尽管MMPs参与软骨基质降解，但其作用的显著性、广泛性及作用机制仍需继续深入研究。

MMPs对关节软骨损伤后的表达具有时空调控性[10]，受生长因子的调节。MMP-2、MMP-3和MMP-9被认为是关节软骨退变的关键酶。MMP-2主要由滑膜下组织细胞合成，位于软骨细胞基质和胞质，其表达与降解呈正相关。MMP-2对软骨ECM的退变起着重要作用。MMP-3在软骨受到刺激后能降解基质和激活MMPs家族其他酶原，特别是能激活MMP-2、MMP-9等基因引起关节结构的破坏，从而降解Ⅱ型胶原。MMP-2和MMP-9与骨侵蚀相关，可作为骨关节破坏的预测指标[12]。

本次实验中，首先成功培养出关节软骨细胞及建立体外机械损伤模型和实时荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-3和MMP-9。MMP-2损伤后1 d和3 d较正常组上升，7 d上升达最高。MMP-3损伤后1、3、7 d较正常组呈下降趋势，3 d和7 d下降到最低。MMP-9损伤后3 d上升到最高，7 d开始呈下降趋势。

本研究结果显示，在体外关节软骨细胞正常和机械损伤后，MMP-2、MMP-3和MMP-9因子显示不同的表达规律，可为在体外通过调节损伤软骨细胞内源性基因表达来促进软骨细胞的修复，为促进损伤关节软骨愈合提供重要的分子生物学基础。

[参考文献]

[1] MACRINI TE,COAN HB,LEVINE SM,et al.Reproductive status and sex show strong effects on knee OA in a baboon model[J].Osteoarthritis Cartilage,2013,21(6):839.

[2] 马子君,赵海洋,任俊丽.凋亡与增殖相关基因在损伤关节软骨细胞中的表达[J].解剖学杂志,2013,36 (5):884.

[3] KUCUKGUVEN A,KHALIL RA.Matrix metalloproteinases as potential targets in the venous dilation associated with varicose veins[J].Curr Drug Targets,2013,14(3):287.

[4] 任俊丽,马子君,白笙君.细胞外基质因子在兔软骨细胞损伤模型中的表达变化[J].解剖学杂志,2015,38(3):1001.

[5] 李叔强，扬帆，张新，等.先天性胫骨假关节骨膜组织中基质金属蛋白酶对骨生成的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(2):213.

[6] 赵海洋,马子君,任俊丽.生长因子在兔软骨细胞损伤模型中表达[J].解剖学杂志,2014,34(2):154.

[7] JIN L,ZHAO J,JING W,et al.Role of miR-146a in human chondrocyte apoptosis in response to mechanical pressure injury in vitro[J].Int J Mol Med,2014,34(2):451.

[8] LEYH M,SEITZ A,DURSELEN L,et al.Osteoarthritic cartilage explants affect extracellular matrix production and composition in cocultured bone marrow-derived mesenchymal stem cells and articular chondrocytes[J].Stem Cell Res Ther,2014,5(3):77.

[9] BENJAMIN MM,KHALIL RA.Matrix metalloproteinase inhibitors as investigative tools in the pathogenesis and management of vascular disease[J].EXS,2012,103:209.

[10] XU X,XIAO L,XIAO P,et al.A glimpse of matrix metalloproteinases in diabetic nephropathy[J].Curr Med Chem,2014,21(28):3244.

[11] LOVETT DH,MAHIMKAR R,RAFFAI RL,et al.A novel intracellular isoform of matrix metalloproteinase-2 induced by oxidative stress activates innate immunity[J].PLoS One,2012,7(4):e34177.

[12] 吴振彪,卢宁,王彦宏.基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9与类风湿性关节炎关节破坏的关系[J].中国免疫学杂志,2006,22(3):260.