由脑梗死、脑卒中或心脏骤停引起缺血性脑损伤是临床常见病、多发病，其高致死和致残严重影响病人生存质量。其发病机制为缺血脑组织中细胞能量供给不足与细胞代谢的失平衡导致了组织缺氧及微血管功能障碍[1-2]。AMPK激活剂AICAR是一种能够渗透细胞的天然代谢物，具有潜在的抗炎和抗细胞增殖活性，可以活化磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)，调节细胞能量代谢[3-5]。有研究[3]发现，在肠缺血再灌注损伤中，AICAR能够减少组织器官损伤及炎症反应，能够抑制星形胶质细胞脂多糖(LPS)诱发炎症模型中的多种促炎因子，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)蛋白的表达上调[6]。而AICAR对脑缺血后星形胶质细胞的功能作用及炎性反应，研究还很少。本研究旨在利用原代星形胶质细胞和神经元的糖氧剥夺(OGD)模型，通过观察AICAR对糖氧剥夺损伤(拟缺血)后星形胶质细胞炎性反应及对糖氧剥夺处理后神经元损伤的影响，分析其在OGD损伤中的作用及可能的作用机制，进一步揭示AMPK通路在脑缺血损伤中的作用，为临床治疗提供理论基础。现作报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只新生24 h C57BL/6小鼠，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。动物许可证号：SYXK(苏)2016-0010。

相比前几年惠民政策，今年黑龙江销售公司在惠民方面最大的亮点是增加了折扣卡的优惠政策。但什么样的客户可享用折扣卡？这就需要所属分公司对自身客户有一个全面了解。

1.1.2 仪器与设备 手术显微镜购自World Precision Instrument公司。Mini Trans-Blot电转印槽、ChemiDox XRS凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。冷冻切片机和TCS SP8激光共聚焦显微镜购自Leica公司。

1.2.5 LDH试剂盒检测细胞损伤指标 按照LDH试剂盒说明书，设置对照组，即high control和low control组。细胞的损伤程度按照(experiment value-low control)/(high control-low control)公式计算。

2.1 原代星形胶质细胞和原代神经元的OGD及损伤评价 通过OGD模型在细胞水平模拟缺血损伤，LDH检测作为损伤评价指标，模型中原代神经细胞经OGD处理后LDH显著增加，提示OGD处理能够造成原代星形胶质细胞和神经元损伤(P<0.01)(见表1)。通过对星形胶质细胞标记物GFAP的免疫荧光标记，结果也显示星形胶质细胞在OGD损伤后被激活，表现为GFAP信号增强，细胞体积增大等(见图1)。

1.2.4 ELISA检测原代培养星形胶质细胞培养上清液中TNF-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6蛋白的表达 上述原代培养的星形胶质细胞先在细胞培养液中加入等体积的DMSO溶剂和AICAR，后经4 h的OGD处理，按照小鼠种属TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA 试剂盒说明书，分别吸取复氧后12 h对照组(DMSO)和AICAR组的细胞培养液，1 000 g离心20 min，取上清作为待测品，采用ELISA法统一测定浓度。

2.2 AICAR对缺糖缺氧损伤的原代星形胶质细胞炎性反应的影响 与对照组DMSO比较，AICAR处理后明显降低了OGD刺激诱导星形胶质细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6(P<0.01)(见表2)。

注射用青霉素钠（山东鲁抗医药股份有限公司，批号L121021）；生理盐水（山东齐都药业有限公司，批号7B12121705）；石蜡（上海华永石蜡有限公司，批号20140506）；大鼠BNP试剂盒（批号201704）、大鼠Ang II ELISA试剂盒（批号201704）、大鼠β1‐AR ELISA试剂盒（批号201704）、大鼠AT1 ELISA试剂盒（批号201704），购自南京建成生物工程研究所。

1.2.1 原代神经元、星形胶质细胞分离、培养 将新生24 h小鼠冰冻麻醉断颈，打开颅骨，在手术显微镜下剥去脑膜、血管，分离出大脑皮层脑组织，经0.05%胰酶消化,离心30 min，按3×105～5×105/mL种于24孔板。星形胶质细胞用DMEM高糖培养基,神经元用Neurobasal加B27培养基，24 h后加阿糖胞苷，具体步骤见参考文献[7]。

1.2.2 原代培养神经细胞OGD模型 原代培养细胞用D-Hank′s缓冲液冲洗3遍，加入DMEM(无糖)培养基，置于密封的缺氧盒中，通入含有95% N2 和5% CO2混合气体，移至37 ℃培养箱培养，4 h后取出，复氧且更换正常培养基，同时加入预先OGD处理的星形胶质细胞培养液，第12小时收取细胞进行后续操作。

1.2.3 免疫荧光染色检测OGD处理后原代培养神经元损伤 原代培养神经元种于24孔板的玻璃爬片，后经OGD处理4 h再复氧12 h的时间点收取细胞，用D-Hank′s缓冲液冲洗1遍，4%多聚甲醛室温固定1 h，PBS洗3次，每次5 min。封闭液封闭后，孵育一抗(小鼠抗NeuN和兔抗MAP2)、荧光二抗(Alexa Fluor 594抗小鼠和Alexa Fluor 488抗兔)后，TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜进行扫描拍照。

1.2 实验方法

1.1.3 药品与试剂 AICAR(每瓶25 mg)购自Sigma公司。DMEM高糖培养基，D-Hank′s 缓冲液，胎牛血清，Neurobasal，B27，0.25%胰酶 购自Invitrogen公司。细胞过滤网(70 μm)购自基因公司。小鼠抗NeuN和兔抗MAP2抗体购自Millipore公司，Alexa Fluor 594标记的驴抗小鼠IgG和Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG购自Invitrogen公司，密闭缺氧盒购自Billups-Rothenberg公司，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自罗氏公司。Elisa试剂盒(96T)购自上海拜沃公司。

2.3 AICAR对缺糖缺氧损伤星形胶质细胞中磷酸化p38表达的影响 利用Western blotting方法对AICAR干预后OGD损伤星形胶质细胞中磷酸化p38的表达进行半定量检测，结果显示,与对照组DMSO比较，AICAR组磷酸化p38的蛋白表达显著下调(见图2)，经图像灰度分析，差异有统计学意义(P<0.05)。

1.3 统计学方法 采用t检验、方差分析和q检验。

2 结果

根据测试结果可知突出物间距对纱线牵引力大小的影响，当突出物间距增加到10mm时，牵引力大小趋于稳定，这与数值模拟的结果一致。

其中，O为无穷远点。我们称Ep(a,b)为素数域Fp上的椭圆曲线。椭圆曲线EP(a,b)上的点数用#EP(a,b)表示，称为椭圆曲线的阶。

表1 OGD处理后原代星形胶质细胞和神经元损伤评价

细胞n复氧0h复氧12h复氧24h复氧48hFPMS组内原代星形胶质细胞600．21±0．020．07±0．01∗∗0．08±0．01∗∗0．1±0．01∗∗1428．57<0．010．002 原代神经元600．39±0．080．67±0．07∗∗0．62±0．05∗∗1．05±0．35∗∗131．87<0．010．034

q检验：与复氧0 h组比较**P<0.01

坂口安吾：对我这样的人来说，青春绝不意味着美丽，也不是什么特别的东西。倘若如此，青春是什么呢？青春只是使我活着的力量，是各种愚蠢但又一直多少支撑着我生命燃烧的东西，一切支撑着我生命的事物都是我青春经历的对象，这就是我的青春。

表2 AICAR对OGD损伤星形胶质细胞分泌促炎因子表达的影响

分组nTNF⁃αIL⁃1βIL⁃6对照组DMSO60314．6±10．11652．5±56．4656．7±67．14实验组ICAR60153．3±20．11315．3±40．8223．5±40．44t—12．4137．529．57P—<0．01<0．01<0．01

1.2.6 Western blot法检测磷酸化p38蛋白表达 对照组AICAR组原代星形胶质细胞OGD 4 h复氧12 h后，胰酶消化收取细胞，经RIPA裂解液处理提取总蛋白，通过SDS-PAGE电泳分离后，转至PVDF膜，室温脱脂奶粉封闭2 h，加入β-actin和磷酸化p38单克隆抗体稀释液，4 ℃摇床过夜后，分别加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL显色液显影，Bio-Rad凝胶成像仪进行扫描分析。

2.4 AICAR通过影响星形胶质细胞而降低缺糖缺氧造成的神经元损伤 在原代培养神经细胞的OGD模型中，神经元损伤通过LDH释放和免疫荧光双标法检测神经元突起变化两个方面作为评价标准。通过检测神经元的LDH释放量，OGD处理后的神经元再分别加入AICAR(及对照组干预过的OGD星形胶质细胞培养液，再灌注12 h后，损伤程度分别为0.65±0.09和0.25±0.02，AICAR组的LDH释放量明显低于对照组(t′=33.61，P<0.01)。

通过对成熟神经元特异性标记物NeuN和树突标记物MAP2的免疫荧光双标，结果显示与对照组相比，OGD损伤的原代培养神经元，在加入AICAR干预的星形胶质细胞培养液后(AICAR组)，神经元的突起长度和密度都有增加。

加强农业品牌建设，有助于实现农业可持续发展。加强农业品牌建设，保证农产品品质优良、安全是农业品牌建设的核心要素。在品牌建设中突出绿色、高效、安全、质优等特征，可提升资源利用率，实现农业可持续发展。

3 讨论

缺血性脑血管病是一类血管源性的神经功能缺陷和中枢神经系统损伤疾病的统称，具有高发病率、死亡率及致残性的临床特点[8]，其病理过程由于脑血管中血流突然中断引起的神经元功能障碍，而再灌注过程进一步引发炎性反应造成神经元损伤甚至不可逆性死亡。因此，如何减少缺血再灌注过程中的神经元损伤对于治疗缺血性脑病起到关键作用。AICAR是一种具有潜在的抗炎作用[3]以及低功耗模拟属性的天然代谢物[4]，能够渗透细胞，是已被证实的特异性AMPK激活剂[9]。AMPK是一种代谢变化敏感的蛋白激酶家族成员之一，因能量供给不足而活化，通过调控细胞代谢途径而维持机体能量平衡[10]。本研究发现，正常剂量AICAR加入原代星形胶质细胞培养液，能够显著地抑制OGD损伤后星形胶质细胞分泌促炎因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6。且将AICAR干预过的OGD损伤星形胶质细胞细胞培养液加入OGD损伤神经元，能够显著地减少OGD造成的神经元损伤，促进突起修复。以上结果提示AICAR能够对OGD损伤神经元有保护作用，其机制可能通过抑制OGD损伤中星形胶质细胞分泌炎症细胞因子而减轻炎症反应。

脑缺血损伤后，星形胶质细胞在各种缺氧信号刺激下分泌出多种炎性细胞因子，其中包括TNF-α、IL-1β和IL-6等，参与缺血诱导的炎症反应，而加重对神经元的损伤[11-12]，因而有效地减少星形胶质细胞的炎性反应，将有利于减少炎症因子对缺血区神经元的损伤。有研究[6]发现，AICAR能够通过抑制星形胶质细胞分泌炎症因子TNF-α等，而减弱LPS诱导的炎症反应。近来研究发现，激活AMPK磷酸化能够减少新生儿缺血缺氧性脑病小鼠模型的神经元损伤[13]，而在缺血损伤中对星形胶质细胞的影响还未知，AICAR是否能够通过抑制缺血后星形胶质细胞分泌炎性因子而对神经元产生损伤保护作用。因而本研究利用原代神经元和星形胶质细胞OGD模型，在正常星形胶质细胞培养液中加入AICAR后给予OGD处理，检测星形胶质细胞培养液中炎症因子的分泌量，同时将星形胶质细胞收集提取蛋白，通过Western blotting检测磷酸化p38的表达变化，结果发现AICAR能够显著地降低OGD损伤星形胶质细胞分泌炎症因子，且能够显著地抑制星形胶质细胞中p38 MAPK信号通路活化，已有大量研究[14-18]发现p38MAPK信号通路对炎症反应具有重要的调控作用[14-18]，提示AICAR可能是通过抑制p38磷酸化而抑制炎性因子分泌。进一步将复氧12 h的星形胶质细胞培养液加入预先OGD损伤的神经元中，通过LDH检测和免疫荧光标记，发现经过AICAR干预的星形胶质细胞培养液能够显著降低缺糖缺氧造成的神经元损伤。

综上，本研究发现AICAR在OGD模型中，能够抑制原代星形胶质细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6，下调磷酸化p38表达，且AICAR干预的OGD星形胶质细胞培养液能够减少OGD原代神经元损伤，促进突起修复。因此，我们推测AICAR在脑缺血损伤中可能通过抑制星形胶质细胞分泌促炎因子，而减少炎症反应，对损伤神经元具有保护作用。

[参考文献]

[1] ELTZSCHIG HK,ECKLE T.Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation[J].Nat Med,2011,17(11):1391.

[2] 吴咏梅,陶茹莹,孟祥宝,等.缺血性脑卒中损伤机制研究进展[J].吉林中医药,2018(3):368.

[3] IDROVO JP,YANG WL,JACOB A,et al.AICAR attenuates organ injury and inflammatory response after intestinal ischemia and reperfusion[J].Mol Med,2015,20:676.

[4] CESCHIN J,HÜRLIMANN HC,SAINT-MARC C,et al.Disruption of nucleotide homeostasis by the antiproliferative drug 5-aminoimidazole-4-carboxamide -1-β-d- ribofuranoside monophosphate (AICAR)[J].J Biol Chem,2015,290(39):23947.

[5] 蔚海霞,冉强强,王明山，等.AMPK激活剂对老年大鼠全脑缺血再灌注海马神经元凋亡影响[J].青岛大学医学院学报,2015(6):650.

[6] GIRI S,NATH N,SMITH B,et al.5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-4-ribofuranoside inhibits proinflammatory response in glial cells:a possible role of AMP-activated protein kinase[J].J Neurosci,2004,24(2):479.

[7] GIORDANO G,COSTA LG.Primary neurons in culture and neuronal cell lines for in vitro neurotoxicological studies[J].Methods Mol Biol,2011,758:13.

[8] NEUHAUS AA,COUCH Y,HADLEY G,et al.Neuroprotection in stroke:the importance of collaboration and reproducibility[J].Brain,2017,140(8):2079.

[9] VINCENT EE,COELHO PP,BLAGIH J,et al.Differential effects of AMPK agonists on cell growth and metabolism[J].Oncogene,2015,34(28):3627.

[10] CARLING D.Ampk[J].Curr Biol,2004,14(6):R220.

[11] ZIEMKA-NALECZ M,JAWORSKA J,ZALEWSKA T.Insights into the neuroinflammatory responses after neonatal hypoxia-ischemia[J].J Neuropathol Exp Neurol,2017,76(8):644.

[12] TUTTOLOMONDO A,DI RAIMONDO D,DI SCIACCA R,et al.Inflammatory cytokines in acute ischemic stroke[J].Curr Pharm Des,2008,14(33):3574.

[13] SHI X,XU L,DOYCHEVA DM,et al.Sestrin2,as a negative feedback regulator of mTOR,provides neuroprotection by activation AMPK phosphorylation in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy in rat pups[J].J Cereb Blood Flow Metab,2017,37(4):1447.

[14] GAO Y,HOU R,LIU F,et al.Obacunone causes sustained expression of MKP-1 thus inactivating p38 MAPK to suppress pro-inflammatory mediators through intracellular MIF[J].J Cell Biochem,2018,119(1):837.

[15] CHEN D,PAN D,TANG S,et al.Administration of chlorogenic acid alleviates spinal cord injury via TLR4/NFkappaB and p38 signaling pathway antiinflammatory activity[J].Mol Med Rep,2018,17(1):1340.

[16] CHO RL,LIN WN,WANG CY,et al.Heme oxygenase-1 induction by rosiglitazone via PKCalpha/AMPKalpha/p38 MAPKalpha/PPARgamma pathway suppresses lipopolysaccharide-mediated pulmonary inflammation[J].Biochem Pharmacol,2018,148:222.

[17] GREEN JP,SOUILHOL C,XANTHIS I,et al.Atheroprone flow activates inflammation via endothelial ATP-dependent P2X7-p38 signalling[J].Cardiovasc Res,2018,114(2):324.

[18] HE Y,SHE H,ZHANG T,et al.p38 MAPK inhibits autophagy and promotes microglial inflammatory responses by phosphorylating ULK1[J].J Cell Biol,2018,217(1):315.