宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，在全世界女性恶性肿瘤中，其发病率位居第3位，且在发展中国家女性中，该病的发病率及其导致的患者死亡率高于发达国家[1]。根据《2013年肿瘤登记年报》显示，中国每年新增病例约15万，其中约8万死于此病。2008年诺贝尔医学奖获得者证明，人类乳头瘤病毒(HPV)感染是引起宫颈癌发生的主要病因，特别是与高危型HPV持续感染(间隔1年以上的时间，连续两次检测出同一高危型的HPV)密切相关，这一里程碑式的发现，成为了HPV疫苗研发的根据，近年来HPV 疫苗已经上市使用，但是HPV疫苗主要为预防性疫苗，是用来预防HPV感染的，现在还不能认为“HPV疫苗可以预防宫颈癌”。在医学飞速发展的当今，对宫颈癌治疗的研究也不断深入，相应的也出现了多种多样的治疗模式[2]。目前，在临床上，以铂类为主的化疗仍然是宫颈癌的主要治疗方式。作为细胞周期非特异性的化疗药物——顺铂，具有广谱的癌细胞杀伤效应，但是仍然难免有部分宫颈癌患者仍会出现的严重的顺铂耐药现象及免疫功能低下等毒性不良反应，从而影响化疗效果和患者的耐受性及依从性[3]，面对这一严峻的现象，寻求一种既可以提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性又可以降低顺铂毒性不良反应的方法成为了临床医生的关注重点。近年来很多体内外研究提示，中药黄芪的主要有效成分之一黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides)，不仅具有免疫调节、抗衰老、抗病毒、抗氧化、保肝护肾、抗疲劳的作用，而且还具有抗肿瘤、抗应激等功效[4-5]。此外，临床研究发现，黄芪多糖在肿瘤患者的化疗过程中可以降低化疗的不良反应，减少化疗所致的骨髓抑制，同时还可以提高肿瘤患者机体的免疫水平[6-7]。2017年3—5月，本研究采用黄芪多糖联合顺铂的方式处理宫颈癌siha细胞，探讨黄芪多糖协同顺铂诱导宫颈癌siha细胞凋亡的可能作用机制，为黄芪多糖通过发挥其抗肿瘤效应并对顺铂起到辅助化疗增敏作用而应用于临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌siha细胞株由广东省中医院科学院中心实验室妇科肿瘤团队提供。黄芪多糖冻干粉(批号：0080A)、顺铂(批号：M0501A)均购自美伦生物股份有限公司。主要试剂：DMEM高糖培养基(批号8116402)、胎牛血清(南美血源，批号42G5163K)、含EDTA胰酶(批号1713949)，均购自Gibco公司；PBS缓冲液(Hyclone公司，批号AAJ207798)；DMSO(MP公司，批号：6349K)；MTT粉(MP公司，批号M5178)；Annexin V/PI apoptosis kit(杭州联科生物有限公司，批号73001114)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5X(批号：P0015)、RIPA裂解液(批号：P0013B)，均购自碧云天；预染蛋白Marker10-170KD(Fermentas公司，批号：00447205)ECT发光液(Millipore公司，批号：1530902)；BCA Protein Assay Kit(Thermo公司，批号190983);ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore 公司，批号1530902);caspase3 Rabbit mAb(批号：9665)、caspase7 Rabbit mAb(批号：1282)、caspase9 Mouse mAb(批号：9508)、β-actin Mouse mAb(批号：3700T)，Anti-rabbit IgG,HPR-klinked Antibody (批号：7074)均购自CST；Anti-mouse IgG,HPR-klinked Antibody(ASBIO公司，批号：3700T)；Bcl-2 Rabbit mAb(Boster公司，批号：196814)。主要仪器： VICTOR X5型号酶标仪(美国Perkinelmer公司)；DMI 3000型号倒置生物显微镜(LEICA 公司)；FC500型号流式细胞分析系统(美国BECKMAN公司)；Universal Hood Ⅱ型号化学发光成像系统(bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将宫颈癌siha细胞接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基，在5% CO2、37℃，饱和湿度条件下培养。将处于对数期生长的siha细胞用含0.25% EDTA 的胰酶消化后按1∶3～1∶5进行传代。

1.2.2 药物配备 黄芪多糖冻干粉，用DMSO配制成40 g/L的母液,30 μL分装，置-20℃冰箱保存备用。顺铂冻干粉剂，用基础的DMEM培养基配制成1 g/L的母液，置-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 实验药物浓度的选择 我们在本实验之前做了相关的预实验，本实验中的药物浓度选择是依据预实验的结果，因此本实验中的给药浓度选定为：黄芪多糖100 mg/L，顺铂2.5 mg/L。

1.2.4 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测siha细胞的增殖抑制率 将对数生长期siha细胞接种于96孔板中，细胞密度为4×105·mL-1，每孔200 μL细胞悬液，培养24 h后分别弃原培养基，空白组不加药物，黄芪多糖组给药100 mg/L，顺铂组给药2.5 mg/L，联合给药组给黄芪多糖100 mg/L +顺铂2.5 mg/L，每组设6个复孔，继续培养24、48、72 h后，弃掉旧培养基，加入20 μL MTT(浓度为5 g/L)，培养箱孵育4 h，小心吸出上清，加入150 μL DMSO轻微振荡10 min后终止反应，上机，使用酶标仪在570 nm波长下检测各孔OD值。计算细胞增值抑制率：细胞增值抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI 双染法检测各组siha细胞的凋亡情况 取对数生长期siha细胞接种于6孔板中，细胞密度为1.5×105·mL-1，将细胞分为对照组、黄芪多糖组、顺铂组、黄芪多糖联合顺铂组，接种24 h后吸出培养液，给药，对照组不加药物，黄芪多糖组加入黄芪多糖使之终浓度为100 mg/L，顺铂组加入顺铂使之终浓度为2.5 mg/L，黄芪多糖联合顺铂组加入终浓度为100 mg/L的黄芪多糖和终浓度为2.5 mg/L的顺铂，继续培养24 h后弃去旧的培养液，PBS洗涤细胞1次，用不含EDTA胰酶常规消化1 min，离心收集细胞，加入500 μL 1×binding buffer后振荡，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。涡旋混匀，室温避光孵育5 min，使用流式细胞分析系统检测细胞凋亡率。

1.2.6 蛋白印迹法检测各组siha细胞凋亡相关蛋白caspase3、caspase7、caspase9和Bcl-2的表达情况 取对数生长期siha细胞接种于6孔板中，细胞密度为1.5×105·mL-1，将细胞分为对照组、黄芪多糖组、顺铂组、黄芪多糖联合顺铂组，接种24 h后吸出培养液，给药，对照组不加药物，黄芪多糖组加入黄芪多糖使之终浓度为100 mg/L，顺铂组加入顺铂使之终浓度为2.5 mg/L，黄芪多糖联合顺铂组加入终浓度为100 mg/L的黄芪多糖和终浓度为2.5 mg/L的顺铂，继续培养24 h后收集细胞,提取蛋白。蛋白免疫印迹检测的具体操作步骤参照文献[8]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行正态性及方差齐性检验，定量资料以表示， 两两组间比较采用 t 检验， 多组间比较采用单因素方差分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组siha细胞的增殖抑制情况 与对照组相比，黄芪多糖组、顺铂组、黄芪多糖联合顺铂组中siha细胞的增殖均具有明显的抑制作用(P<0.05)，且呈时间依赖性；与单独给药组相比，黄芪多糖联合顺铂组中siha细胞的增殖抑制作用显著(P<0.01)。见表1、2。

 

表1 各组siha细胞的增殖情况(OD值)

  

组别24h48h72h对照组0.93±0.050.79±0.050.87±0.03黄芪多糖组0.41±0.06**△0.49±0.02**△0.43±0.01**△顺铂组0.61±0.54*△0.44±0.03**△0.31±0.02**△黄芪多糖联合顺铂组0.32±0.03**0.22±0.02**0.15±0.02**

 

与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01；△与黄芪多糖联合顺铂组比较P<0.05

 

表2 各组siha细胞的增殖抑制率

  

组别24h48h72h对照组000黄芪多糖组 45.23±0.15**△ 48.13±0.12**△ 52.94±0.11**△顺铂组34.29±0.23*△43.88±0.08**△63.83±0.21**△黄芪多糖联合顺铂组59.94±0.13**72.30±0.25**80.50±0.20**

 

与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01；△与黄芪多糖联合顺铂组比较P<0.05

2.2 各组siha细胞的凋亡情况 与对照组相比，黄芪多糖组、顺铂组、黄芪多糖联合顺铂组中siha细胞的凋亡率明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)；与单独给药组相比，黄芪多糖联合顺铂组中siha细胞的凋亡率显著增加(P<0.01)。见表3、图1。

 

表3 各组siha细胞的凋亡情况

  

组别细胞凋亡率(%)对照组0.90±0.33黄芪多糖组3.50±1.91*△顺铂组9.30±3.47**△黄芪多糖联合顺铂组18.35±5.29**

 

与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01；△与黄芪多糖联合顺铂组比较P<0.05

2.3 各组siha细胞凋亡相关蛋白的表达情况 与对照组相比，黄芪多糖组、顺铂组中caspase3、caspase7、caspase9蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.05)；黄芪多糖联合顺铂组的上述变化更加显著(P<0.01)。见表4、图2。

3 讨论

细胞凋亡又称之为细胞程序性死亡，即当细胞核DNA的双链结构遭到破坏并且得不到及时修复时， 就会抑制细胞的增殖，从而使细胞程序性死亡[9]。细胞凋亡与凋亡途径密切相关[10]，目前研究较多的凋亡途径——内途径，即线粒体途径，由线粒体释放的细胞色素C与多种caspase蛋白激活物组装成的凋亡复合体来诱导细胞凋亡的发生[11]。

经典语义无法达到这一目的。动态语义是关于单主体的会话结构的计算，或者用来改变个体的内心世界。但语言是关于说话者和听话者之间所建立的公共知识，通过这一途径，合作者或者是竞争者通过有意义的行为参与进来，这就要求对多主体之间交流的信息流进行研究，其中的“社会的”知识主要是其他主体知道的知识以及其他主体之间的期望。在研究单主体的言语行为之前，人们长期专注于研究策略，而对基于时间的行为的研究主要指理想的博弈论的研究。

在凋亡的内途径信号转导中扮演着重要角色之一的Caspase蛋白家族是一组具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是直接导致细胞凋亡解体的蛋白酶系统[12]；另外一种Bcl2蛋白，是Bcl2家族中最主要的成员， Bcl2蛋白通过抑制线粒体膜通透性来阻止细胞色素(Cytc)的释放，从而减少caspase9的募集[13]，作为凋亡启动因子的caspase9，不仅可以在凋亡起始信号作用于线粒体，促使线粒体释放出细胞色素(cyt-c) 等促凋亡因子，而且还可以与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1) 结合，使 Apaf-1 改变构象形成八聚体，所形成的八聚体与caspase9结合形成凋亡小体，再次形成的凋亡小体可以进一步诱导催化caspase9，再进一步激活下游的 caspase3、caspase7 等，下游的 caspase3 和 caspase7 直接破坏细胞纤层和细胞结构[14-18]，从而诱导细胞凋亡的发生。由此可知Bcl2、caspase3、caspase7、caspase9在细胞凋亡的内途径中相互作用，从而诱导细胞凋亡的发生。

  

A：对照组；B：黄芪多糖组；C：顺铂组；D：黄芪多糖联合顺铂组

 

图1 AnnexinV-FITC/PI示各组siha细胞凋亡情况

 

表4 各组siha细胞凋亡相关蛋白的相对表达情况

  

组别caspase3/β-actincaspase7/β-actincaspase9/β-actinBcl-2/β-actin对照组0.86±0.180.36±0.100.36±0.120.46±0.19黄芪多糖组1.11±0.14**0.39±0.09*0.56±0.16**0.37±0.12**顺铂组1.31±0.15**0.47±0.14**0.59±0.13**0.35±0.15**黄芪多糖联合顺铂组1.46±0.17**0.41±0.08*0.71±0.14**0.31±0.13**

 

与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01

  

A：对照组；B：黄芪多糖组；C：顺铂组；D：黄芪多糖联合顺铂组

 

图2 各组siha细胞caspase3、caspase7、caspase9、Bcl-2蛋白条带

本研究MTT结果显示，与单独给药组相比，黄芪多糖联合顺铂可以明显增强对siha细胞的抑制作用，流式细胞仪检测结果显示，相对于单独给药组，黄芪多糖联合顺铂可以显著提高siha细胞的凋亡率，使siha细胞对顺铂的敏感性增高，本研究结果表明，黄芪多糖联合顺铂可以明显增强抗肿瘤作用；为进一步对其作用机制进行探究，我们采用蛋白印迹法(Western blot法)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase3、caspase7、caspase9的相对表达水平，结果显示：与对照组相比，黄芪多糖组、顺铂组中caspase3、caspase7、caspase9蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达水平明显下降(P<0.05)；黄芪多糖联合顺铂组的上述变化更加显著(P<0.01)，本研究结果表明黄芪多糖可以使Bcl-2表达水平下调，并且上调 cytochrome C以及凋亡标志物蛋白 caspase9，caspase3、caspase7 的表达，从而启动caspase级联反应，促进siha细胞凋亡， 这说明黄芪多糖可能是通过线粒体途径协同顺铂诱导宫颈癌siha细胞凋亡。

面对严峻的化疗耐药及化疗毒副作用的现象，使得寻求一种能够增加肿瘤细胞化疗敏感性及降低化疗毒副作用的治疗方法成为目前临床及科学研究的重点及热点[19]。近年来，中药在抗肿瘤方面的辅助治疗作用取得了显著成效，备受学者的关注[20-21]。诸多体内外研究提示，作为中药黄芪的主要有效成分之一的黄芪多糖，具有免疫调节、抗衰老、抗病毒、抗氧化、保肝护肾、抗疲劳的作用，而且还具有抗肿瘤、抗应激等功效[4-5]，也有研究表明黄芪多糖对肿瘤细胞具有直接杀伤作用[22], 同时还具有一定诱发肿瘤细胞凋亡的作用[23]，所以更进一步的探究黄芪多糖诱发肿瘤细胞凋亡的分子机制对开启有效的靶向治疗具有重要的意义。

综上所述，本研究提示黄芪多糖具有一定抗肿瘤活性，可以协同顺铂抑制宫颈癌siha 细胞的增殖， 通过线粒体途径协同顺铂诱导宫颈癌siha细胞发生凋亡，增强宫颈癌siha细胞对顺铂的化疗敏感性，有良好的研究及开发前景，但是本研究仅进行了体外的细胞实验研究，具有一定的局限性，若将它开发成为临床上效果显著的化疗增敏剂及抗癌药物，仍需要进一步进行动物体内实验的研究。

综上所述，结合本课例的教学实践，希沃授课助手的“桌面同步”“课件演示”“拍照上传”的功能发挥得淋漓尽致。在“希沃授课助手”新技术的支持下，课堂教学促进了学生的个性发展，达成了新技术与学科教学的深度融合，学生的口语交际能力得到提升。

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