人Bcl2拮抗1(BCL2-antagonist/killer 1,Bak1)基因是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl2) 基因家族的成员，1995年Farrow、Chittenden与Kiefer各自独立克隆，定位于6p21.3-p21.2，包括3个外显子，全长6kb，具有高度的保守性[1-3]。Bak1蛋白定位于线粒体外膜(mitochondrial outer membrane，OM)上，是促进凋亡蛋白，在涉及细胞线粒体途径凋亡中OM的通透化至关重要[4]。前期研究发现[5-6]与非骨质疏松者相比，骨质疏松症患者骨骼肌线粒体通透转换孔活性、松质骨Bak1的表达明显升高。为进一步研究Bak1，本研究于2016年6月至2017年4月对Bak1基因进行克隆，构建了该基因的重组腺病毒表达载体，进行了病毒包装和扩繁及滴度测定，并转染MG63细胞检测其对细胞增殖的影响，现报告如下。

企事业单位及领导人在实践中通过虚假凭证，设置多套账等形成故意性会计信息失真。表现为企业对内外设置一套从会计凭证到账簿信息全部失真的账以及企业设置多套账，针对领导人为完成上级任务和政绩而设置的账簿以及企业经营不好，指使或者强令会计人员做假账簿。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及菌株 人成骨肉瘤细胞(MG63，由中国科学院上海细胞所细胞库提供)、BJ5183感受态细胞(上海杰美基因医药科技有限公司)，DH5α感受态细胞(北京鼎国生物技术有限责任公司)。

1.1.2 工具酶及主要试剂 KpnⅠ、XhoⅠ、PmeⅠ、PacⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶(美国NEB公司)，蛋白酶K(上海碧云天生物科技有限公司)，Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，胶回收/纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(中国天根公司)，RIPA细胞裂解液(美国Sigma公司)，TRIzol Reagent、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、Taq DNA 聚合酶(美国Invitrogen公司)，DMEM培养基、Pen/Strep、胎牛血清、Opti-MEM培养基(美国Gibco公司)，Bak(D4E4)Rabbit mAb(美国CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 重组穿梭质粒pENTER-Bak1的构建 利用Trizol法提取人成骨肉瘤细胞MG63的总RNA，凝胶电泳检测证实RNA的完整性较好后，进行逆转录反应合成cDNA。根据NCBI数据库收录的人Bak1基因全长mRNA序列(Genebank登录号：NM_001188.3)，运用Primer 5.0设计PCR引物，经核苷酸序列酶切位点分析软件分析Bak1基因不包含KpnⅠ及NotⅠ酶切位点，故在上游引物添加KpnⅠ酶切位点(下划线)，下游引物添加NotⅠ酶切位点(下划线)。上游引物序列：5′-GGGGTACCCCATGGCTTCGGGGCAAGGCCCAGGTCC-3′，下游引物序列：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCATGATTTGAAGAATCTTCGTACC-3′，进行PCR扩增得到目的基因片段。反应体系为：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，dNTP Mix(2.5 mM each) 4 μL，DNA Polymerase 0.25 μL，10×PfuUltraⅡreaction buffer 5 μL，补加ddH2O至总体积50 μL。PCR反应条件为：98℃预变性1 min，98℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃冷却10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否与预期相符。

大量扩增目的基因片段并运用胶回收/纯化试剂盒进行回收纯化，利用KpnⅠ、NotⅠ双酶切纯化获得目的基因片段与穿梭质粒pENTER， 酶切反应体系如下：目的基因及穿梭质粒pENTER各20 μL，KpnⅠ、NotⅠ各1 μL，10× universe Buffer 5 μL，加ddH2O至50 μL。37℃，酶反应4 h后，胶回收纯化酶切产物。在T4 DNA酶作用下进行目的基因与穿梭质粒的连接，连接体系为：目的基因及穿梭质粒pENTER各1 μL，T4 ligase 0.5 μL，10× ligase Buffer 1 μL，加ddH2O至10 μL。14～16℃恒温6～12 h。将连接产物转化感受态细胞DH5α，挑选抗性克隆进行酶切鉴定及测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pENTER-Bak1。

1.2.2 重组腺病毒质粒pAd-Bak1的构建 限制性内切酶PmeⅠ线性化重组质粒pENTER-Bak1，脱磷酸化后将其转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞中，将菌液均匀涂布于含氨苄霉素的LB平板孵育过夜，挑以较小的菌落扩繁后用质粒小提试剂盒提取质粒，进行PacⅠ酶切鉴定后再进行经电泳鉴定，将鉴定正确的重组腺病毒质粒命名为pAd-Bak1。

1.2.3 重组腺病毒质粒pAd-Bak1的包装与扩增 重组腺病毒质粒pAd-Bak1经PacⅠ酶切线性化后，用Lipofectamine 2000脂质体转染汇合度为90%～95%的HEK-293细胞包装病毒，转染后待80%左右的293A细胞出现病变效应时收集被感染的细胞和上清，反复冻融裂解(-80℃/37℃)细胞4次，收集病毒悬液，制备第一代的病毒悬液Ad-Bak1，用第一代原病毒悬液感染HEK-293细胞，按上述方法扩增病毒，收集高滴度的病毒悬液，荧光定量PCR法测定病毒滴度。

1.2.4 重组腺病毒感染MG63细胞 人成骨肉瘤细胞MG63培养24 h后，分为正常培养的MG63细胞(空白对照组)、感染空载腺病毒的MG63细胞(NC对照组)及感染重组腺病毒Ad-Bak1的MG63细胞(Ad-Bak1组)，重组腺病毒感染复数(multiplicity of infection，MOI)为50，感染48h后消化收集细胞，qPCR、Western blot检测重组腺病毒感染对Bak1表达水平的影响。

1.2.5 Bak1表达水平的qPCR、Western blot检测 提取1.2.4项中各细胞总mRNA，逆转录为cDNA，qPCR检测Bak1表达水平，反应体系为：7.5 μmol/L基因引物2.0 μL，2×qPCR Mix 12.5 μL，cDNA 2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。PCR反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，45个循环。循环结束后从55℃升高到98℃获取熔解曲线。提取1.2.4项中各细胞总蛋白，用Bradford法作蛋白定量后，按每个样本40 μg总蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗(TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA)4℃孵育过夜，二抗(TBST稀释3 000倍)室温孵育30 min，ECL化学发光显色，X线片显影、定影，将胶片进行扫描存档，Image J软件处理系统分析目标带的灰度值。

1.2.6 MG63细胞增殖的MTT检测 收集对数生长期的MG63细胞，胰蛋白酶消化处理后制成单细胞悬液，将细胞悬液(细胞数约1×104·mL-1)接种于96孔板中培养24 h，分为感染空载腺病毒的MG63细胞(NC对照组)及感染重组腺病毒Ad-Bak1的MG63细胞(Ad-Bak1组)，重组腺病毒感染MG63细胞(MOI=50)，48 h后每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，小心吸去孔内培养液，每孔加入200 μL DMSO，置于摇床上室温低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪OD 490 nm处测量各孔的吸光值并绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计分析软件，计量资料采用表示，资料满足正态性和方差齐性，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，不满足方差齐性则采用Dunnett′s C检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 目的基因Bak1的扩增结果 以逆转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，以PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，在636 bp处可见一清晰条带，与预期目的片段相符，说明成功扩增出Bak1 cDNA目的片段(图1)。

2.2 重组穿梭质粒pENTER-Bak1的鉴定 抽提重组穿梭质粒行酶切鉴定，比对pENTER穿梭质粒(全长为7.5 kb)，电泳结果显示0.6 kb与7.5 kb处可见两条明亮条带(图2)，表明目的片段已经连入穿梭质粒。测序结果显示与NCBI Gene-Bank所公布的基因序列一致(图3)。

  

图1 目的基因的扩增

  

M：DNA Maker；1：重组穿梭质粒ENTER-Bak1经KpnⅠ、NotⅠ双酶切；2：空载pENTER穿梭质粒经KpnⅠ、NotⅠ双酶切

 

图2 重组穿梭质粒的双酶切鉴定

2.3 重组腺病毒滴度的测定 提取制备腺病毒标准品质粒，用ddH2O作为阴性对照，以标准品Ct制作标准曲线，将样品的Ct值代入标准曲线，得出对应病毒液中核酸拷贝数，依公式：vg/mL=(病毒核酸拷贝数/2 μL)×(50 μL/2 μL)×1 mL/200 μL×稀释倍数，计算重组腺病毒滴度为2.07×108 vg/mL。

2.4 重组腺病毒Ad-Bak1上调MG63细胞中Bak1表达 空白对照组、NC对照组及Ad-Bak1组Bak1 mRNA表达量分别为1.010±0.165、1.257±0.166、7.433±0.315。Ad-Bak1组呈现高水平表达，而空白对照组和NC对照组则呈现低水平表达，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)，说明重组腺病毒Ad-Bak1可以在MG63细胞中成功表达。Western blot结果见图4，说明空载腺病毒不能感染细胞表达Bak1蛋白，而重组腺病毒Ad-Bak1可以感染细胞表达Bak1蛋白。

  

图3 部分重组穿梭质粒测序结果

  

图4 重组表达Bak1腺病毒在MG63细胞中的表达

2.5 MTT检测重组腺病毒Ad-Bak1对MG63细胞活性的影响 MTT法检测结果显示NC对照组、Ad-Bak1组细胞活性分别为100.000±7.765、70.687±2.412，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，表明Bak1过表达的MG63细胞的活性低于正常表达的MG63细胞。

3 讨论

骨质疏松的发生与成骨细胞和破骨细胞功能作用密切相关，骨细胞的调亡也是骨质疏松发生机制的研究热点。众多关于细胞调亡的研究提示线粒体中的Bcl2基因家族是细胞调亡调控机制的终末部分，是细胞调亡的重要调控基因[7]。Bak1作为Bcl2家族的促凋亡蛋白，当细胞受到损伤性刺激后，Bcl2 家族蛋白之间发生复杂的相互作用并把信号传递给OM，然后激活Bak1[8]，加速线粒体膜上电压依赖性阴离子通道的开放，从而导致线粒体膜电位的变化和细胞色素C等释放到细胞质中，进而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(主要为Caspase-3)被激活[4]，进而裂解细胞中的蛋白质，加速细胞的凋亡[7,9-10]，已有研究表明凋亡的紊乱可能与肿瘤、自身免疫性疾病等的发生有密切的关系[11]。本课题组前期研究发现骨质疏松症患者Bak1的表达高于非骨质疏松症患者，Bak1与腰椎骨密度成负相关[5-6]。为此本研究构建Bak1重组腺病毒表达载体，为深入研究其在成骨细胞中的作用提供实验基础。

腺病毒是目前用于基因转移最广泛的载体之一，重组腺病毒感染谱广、安全性高、容量大、体外可操作性好[12]。本研究选用pENTER为穿梭质粒，在设计引物时在上下游分别添加了KpnⅠ及NotⅠ酶切位点，使其与穿梭质粒连接。使用PmeⅠ线性化穿梭质粒pENTER-Bak1，脱磷酸化后将其转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞，脱磷酸化处理可以大大减少其自身连接，提高腺病毒重组的成功率。在HEK-293细胞内包装扩繁得到高滴度腺病毒，采用荧光定量PCR法测定病毒滴度，荧光定量PCR法测定结果反映的是完整的病毒颗粒数，能够间接反映病毒的感染力，且该方法操作简单、耗时短、有较高的实用性[13]。通过qPCR和Western blot检测重组腺病毒转染MG63细胞的mRNA和蛋白水平变化，证明Bak1可以在MG63中高效表达，说明成功制备了Bak1重组腺病毒。通过MTT检测过表达Bak1后MG63细胞活性，证明了其抑制增殖作用。本研究应用腺病毒载体与目的基因进行体外连接，率先构建了Bak1基因的重组腺病毒过表达载体，并在HEK-293细胞中包装扩繁得到高滴度腺病毒，验证其能够高效感染MG63细胞并产生大量表达Bak1蛋白，证明了Bak1蛋白对MG63细胞的抑制增殖作用，为进一步研究Bak1的功能提供了理想的生物载体表达系统。

参考文献

[1] Farrow SN, White JH, Martinou I, et al. Cloning of a bcl-2 homologue by interaction with adenovirus E1B 19K[J]. Nature, 1995, 374(6524): 731-733.

[2] Chittenden T, Harrington E, O′Connor R, et al. Induction of apoptosis by the Bcl-2 homologue Bak[J]. Nature, 1995, 374(6524): 733-736.

[3] Kiefer MC, Brauer MJ, Powers VC, et al. Modulation of apoptosis by the widely distributed Bcl-2 homolog Bak[J]. Nature, 1995, 374(6524): 736-739.

[4] Youle RJ, Strasser A. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9(1): 47-59.

[5] 李颖, 白波, 吴伙燕, 等. 骨骼肌线粒体通透转换孔在骨质疏松症中的变化[J]. 中华实验外科杂志, 2011, 28(7): 1071-1073.

[6] 曾国勇. Bcl-2、Bak与骨质疏松症及其中医证型的相关性研究[D]. 广州: 广州中医药大学, 2016: 20-21.

[7] Siddiqui WA, Ahad A, Ahsan H. The mystery of BCL2 family: Bcl-2 proteins and apoptosis: an update[J]. Arch Toxicol, 2015, 89(3): 289-317.

[8] Dewson G, Kluck RM. Mechanisms by which Bak and Bax permeabilise mitochondria during apoptosis[J]. J Cell Sci, 2009, 122(Pt 16): 2801-2808.

[9] Lüthi AU, Martin SJ. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates[J]. Cell Death Differ, 2007, 14(4): 641-650.

[10] Dix MM, Simon GM, Cravatt BF. Global mapping of the topography and magnitude of proteolytic events in apoptosis[J]. Cell, 2008, 134(4): 679-691.

[11] Meier P, Vousden KH. Lucifer′s labyrinth——ten years of path finding in cell death[J]. Mol Cell, 2007, 28(5): 746-754.

[12] Crystal RG. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector[J]. Hum Gene Ther, 2014, 25(1): 3-11.

[13] 孙鹏宇, 张艳玲, 荆玉明, 等. 腺病毒滴度不同测定方法比较[J]. 南方医科大学学报, 2011, 31(2): 234-238.