近年来我国在中药治疗肿瘤方面获得了巨大进步。中药不仅能改善肿瘤患者的生活质量和抑制肿瘤生长[1-3]，中西医联合治疗肿瘤也获得了显著疗效[4-5]。中药治疗肿瘤适应证广、不良反应小，在于其资源丰富和多靶点、多功能的作用特点。从中医角度看，中药抗肿瘤主要通过扶正培本、活血化瘀、清热解毒、软坚散结等，达到提高身体免疫力、清除瘀血、抑制肿瘤生长的目的[6-7]。传统中药通常是全株入药，其有效化学成分不清楚。现代中药应用生物化学等技术提取有效成分，其发展方向可能是西药。但是，中药讲究君臣佐使配伍和整体治疗，这种利用多种中药协同作用的特点是西药所没有的优势。因此，抗肿瘤中药组方的应用仍然是当前我国医药研究的热点。目前我国抗肿瘤中药产品较多，但大多数只作为辅助治疗药物。为了研发一种可作为主治肿瘤的中药，我们采用扶正活血和清热散结的组方原则，结合抗肿瘤细胞实验和动物实验，对30多种中药组方进行了筛选，最后形成一种抗肿瘤活性高、不良反应小的中药组方“DL571”(专利号ZL201410137181.2)。2014年10月至2016年5月本研究通过DL571的体外肿瘤细胞实验和体内抗肿瘤动物实验，旨在研究其对肿瘤细胞的增殖抑制作用和体内抗肿瘤机制，为今后临床应用提供实验依据。

速度采集部分，该系统采用的是带编码器的直流减速电机，电机尾部自带了13线的磁(霍尔)编码器，以减速比20：1的电机为例，车轮转一圈，电机可以输出260个脉冲，倍频之后是1040。编码器的额定工作电压是5V，集成了上拉电阻和比较整形功能，可以直接输出方波。利用stm32上的TIM2编码器功能采集电机输出的脉冲，测出电机的转速。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和小鼠 人慢性髓细胞性白血病细胞株K562购于江阴康众康民生物医药技术有限公司，人鼻咽癌细胞株CNE-1购自上海派通生物科技有限公司，人胰腺癌细胞株SW1990购自上海吉满生物科技有限公司，小鼠肉瘤细胞株S180购自北京富众科技发展有限公司，SPF级雌性KM小鼠体重19～22 g，购自广东省医学实验动物中心[SCK(粤)2013-0002]。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM、小牛血清购自美国GIBCO公司，MTT检测试剂购自南京凯基生物技术有限公司，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自武汉碧云天生物技术公司，兔抗鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、HRP标记羊抗兔IgG抗体为美国epitomics公司产品。人工牛黄和紫河车干粉由广州市东来生物科技有限公司提供，其余中药材购自当地药店。Trans-Blot SD半干转印槽购自美国BIO-RAD公司。

1.2 中药DL571制备方法 DL571浓缩液制备。植物中药牛膝、桃仁、川芎各12 g，丹参、丹皮、刺五加、黄芩、薏苡仁、柠果、元参、蛇床子、莪术各10 g，藏红花5 g，粉碎，按中药∶水=100∶200(g/mL)比例，于30℃、pH=6.5浸泡24 h，升温煎熬3 h；放置至室温，按乙醇∶煎液=1∶3(V/V)比例加入无水乙醇，置冰箱(5℃)过夜，过滤得抽提液1。非植物中药人工牛黄0.03 g，龟板、鸡内金各10 g，海马、紫河车干粉各5 g，粉碎，按中药粉∶75%无水乙醇=100∶150(g/mL)比例于30℃、pH=6.5浸泡24 h，升温回流3 h，过滤得抽提液2。合并抽提液1和2，冰箱5℃过夜，过滤，以真空干燥法制备成DL571浓缩液(100 mg/mL)。

1.3 肿瘤细胞增殖抑制实验 DL571抗肿瘤细胞活性采用MTT法测定。对数生长期肿瘤细胞接种于96孔板，168 μL/孔，细胞浓度5×104·mL-1，培养基DMEM含10%小牛血清。加入DL571工作液32 μL/孔(DMEM稀释)至最终药物浓度分别为0、20、40、80、160 μL/mL，设3复孔。按四氮唑盐(MTT)试剂盒操作说明书测定各孔的吸光值(OD490)，以DL571浓度对OD490绘制细胞生长抑制曲线，计算DL571的IC50。

1.4 肿瘤细胞流式检测 按上述实验培养K562细胞，DL571干预48 h，最终药液浓度分别为0、80 μL/mL。以生理盐水和结合缓冲液依次洗涤、重悬，加入Annexin V和PI避光反应30 min，进行双染流式检测细胞的凋亡情况。

单染流式检测按上述实验以DL571干预K562细胞48 h，生理盐水洗涤，70%乙醇固定，离心，PBS洗涤后加PI染液，避光反应30 min，进行单染流式分析细胞周期。

1.5 抗肿瘤动物实验 参照文献[8]进行体内抗肿瘤动物实验。小鼠S180肉瘤细胞株以PBS配成1.0×107·mL-1细胞悬液，按0.1 mL/只注射于小鼠右侧腋窝皮下，制备S180肿瘤小鼠模型。待肿瘤直径达到约5 mm大小，选择瘤体大小相对一致的30只小鼠随机分为3组，10只/组。空白对照组不作任何处理，阴性对照组予以生理盐水0.1 mL/10 g灌胃，1次/d；治疗组给予DL571药液0.1 mL/10 g灌胃，1次/d；给药4周。观察小鼠进食和活动情况，每7 d测量肿瘤体积，计算肿瘤大小[9]：V(mm3)=3.14ab2/6(a、b分别为肿瘤的长和宽,单位为mm)。种瘤第5周结束实验，脱臼法处死小鼠，剥离瘤体并称重，按“抑瘤率=100%×(对照组瘤重-治疗组瘤重)/对照组瘤重”的公式计算药物抑瘤率。

1.6 肿瘤组织iNOS蛋白分析 参照Takaoka和Chen方法[10-11]，分别提取各组肿瘤组织的总蛋白，采用Western blot法分析iNOS蛋白表达水平。组织样品在RIPA裂解液中匀浆(4℃)，离心取上清液，以BCA试剂盒测定总蛋白质含量。取相当于40 μg总蛋白以10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，4%脱脂牛奶封闭1 h，一抗孵育(4℃)过夜。TBST洗涤PVDF膜后加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤，以发光混合液进行化学发光。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件，以表示。采用单因素方差(one-way ANOVA)分析组间差异，采用SNK法进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DL571对肿瘤细胞增殖抑制作用 MTT结果显示，DL571分别与K562、CNE-1、SW1990细胞株培养48 h后，能显著抑制细胞增长。随着DL571浓度增高，肿瘤细胞的活性逐渐降低，对K562、CNE-1和SW1990的IC50分别是69、74和63 μL/mL，药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用有显著的量效关系。见表1。

 

表1 DL571对肿瘤细胞生长抑制的MTT测定(OD490)

  

项目0μL/mL20μL/mL40μL/mL80μL/mL160μL/mLIC50K5621.126±0.1320.978±0.0670.763±0.0600.477±0.0540.213±0.04169CNE11.173±0.1460.974±0.0730.792±0.0770.576±0.0610.266±0.04874SW19901.144±0.1120.896±0.0620.761±0.0660.459±0.0510.182±0.03763

2.2 DL571对K562细胞周期及凋亡的影响 经DL571干预48 h后，流式分析结果显示药物组较对照组出现大量细胞凋亡(图1-A、B)，药物对K562细胞有显著的促凋亡作用。PI单染流式结果显示细胞的二倍体显著增加，G1期减少，G2期增加(图1-C、D)，细胞增殖阻滞于M期，细胞周期延长，分裂减慢。

2.3 DL571体内抗肿瘤活性 各组小鼠在实验期间无显著毒性反应和死亡，肿瘤体积均随时间增大。DL571干预2周后，治疗组肿瘤体积明显小于空白对照组和阴性对照组，差异随时间而增加。药物干预4周后空白对照组、阴性对照组的肿瘤体积均比治疗组大，显示治疗组的抑瘤效果显著(P<0.05)。见表2。实验结束后测得空白对照组、阴性对照组的肿瘤重量大于治疗组。空白对照组与阴性对照组瘤重相比差异无统计学意义(P>0.05)，但治疗组显著小于阴性对照组的瘤组织重量(P<0.05)，抑瘤率为52.8%，DL571有显著的体内抑瘤功效。见表2。

2.4 DL571对肿瘤组织iNOS蛋白水平的影响 Western blot检测结果显示，正常小鼠皮下组织iNOS蛋白处于低表达水平，而肿瘤组织则呈显著高表达。与阴性对照组肿瘤组织相比，治疗组肿瘤组织的iNOS蛋白水平明显较低，见图2，DL571干预治疗可能部分抑制肿瘤组织iNOS蛋白的高表达。

  

A、B：流式分析；C、D：PI单染流式分析；A、C：对照组；B、D：药物组

 

图1 DL571对肿瘤细胞K562凋亡与细胞周期的影响

 

表2 DL571对小鼠体内移植瘤生长抑制的测定

  

组别0d7d14d21d28d空白对照组36.55±12.30261.58±28.761592.63±238.272452.54±308.084750.57±376.53阴性对照组42.79±13.20195.71±31.841805.17±241.882787.85±310.965236.21±385.72治疗组38.15±11.28113.17±25.16808.30±153.941044.27±252.47*1999.68±293.21*

 

*与阴性对照组比较P<0.05

  

N：空白正常组； D：治疗组；C：阴性对照组

 

图2 小鼠肿瘤组织的iNOS蛋白Western blot分析

3 讨论

气滞血瘀、痰湿淤结可导致肿瘤患者气血两虚，并贯穿肿瘤的发生和发展，故中医治疗肿瘤尤其重视扶正祛邪以增强机体免疫力[12-13]。DL571由补肾壮阳、活血化瘀、软坚散结、清热利湿、消积健脾等中药组成，符合扶正祛邪原则。其中牛膝、川芎、莪术、海马、蛇床子、紫河车具有补肾壮阳、扶正培本、增强免疫力的功效。藏红花、桃仁、丹参、丹皮活血化瘀，具有流畅血行、疏通血脉而减轻癌痛，同时有利于药物进入肿瘤组织，增强抗肿瘤药物的作用。元参、龟板、刺五加软坚散结，有助于肿块的软化消散。人工牛黄、黄芩、薏苡仁清热利湿，可改善湿热内储之症；鸡内金、柠果消积健脾，可改善营养，利于免疫力恢复。因此，清热利湿和消积健脾药物通过辅助补肾壮阳、活血化瘀、软坚散结药而加强抗肿瘤效果。研究证明，各中药的协同作用能抑制肿瘤细胞增殖、提高机体免疫功能、改善肿瘤微环境以及抗炎消肿，形成多靶点作用机制，有效抑制肿瘤生长[14-17]。

有研究发现，肿瘤组织中iNOS蛋白表达显著增高，可能与局部的炎症反应有关[18]，而iNOS蛋白高表达则促进肿瘤细胞增殖、血管增生和转移[19]，因此，抑制肿瘤细胞iNOS过表达已成为抗肿瘤治疗的新靶点[10，19-20]。本研究结果显示，肿瘤组织iNOS蛋白比正常小鼠相应部位的表达水平显著增高。与阴性对照组相比，治疗组的肿瘤组织iNOS蛋白表达较低，提示DL571部分抑制肿瘤组织iNOS的过表达，可能与方中活血药物的作用有关。由于肿瘤患者常出现血液黏度升高问题，活血中药通过抑制血小板聚集，促进纤维蛋白溶解，抑制血栓形成，从而改善组织微循环和减缓血液黏滞度升高[21]。一方面，活血中药通过改善组织供氧有助于免疫细胞激活、抑制血管增生，同时抑制肿瘤细胞的无氧代谢，因为肿瘤细胞以无氧酵解为主[22]；另一方面，肿瘤组织低氧/缺氧状态促进iNOS蛋白过表达[23-24]，活血中药则通过改善组织供氧而减轻iNOS的过表达。因此，中医抗肿瘤治疗常用活血化瘀中药改善患者的血液流变学，可达到抑制肿瘤代谢和促进抗肿瘤药物作用的效果。

让某些“笔杆子”们遗憾的是，不劳而获的事，迟早是要露馅的。网络时代，“拿来”容易，穿帮也快。上述案例的曝光，多数不是同样因为网络的力量吗？事物总是一分为二的，确然。

本研究发现，DL571在体外显著抑制K562、CNE-1和SW1990肿瘤细胞的增殖，促进K562细胞凋亡，提示该药含有直接抗肿瘤的成分，与体内抗肿瘤实验结果一致。DL571直接抑制肿瘤细胞生长和引起肿瘤细胞凋亡的分子机制尚不清楚，可能是黄芩、丹参、柠果等中药对肿瘤细胞的直接作用[25-27]，而方中活血化瘀中药则可能通过改善组织微循环、促进这些抗肿瘤成分进入肿瘤组织而达到协同治疗的功效。

参考文献

[1] Tao W, Luo X, Cui B, et al. Practice of traditional Chinese medicine for psycho-behavioral intervention improves quality of life in cancer patients: A systematic review and meta-analysis[J]. Oncotarget, 2015, 6(37): 39725-39739.

[2] Xu H, Zhao X, Liu X, et al. Antitumor effects of traditional Chinese medicine targeting the cellular apoptotic pathway[J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9: 2735-2744.

[3] Jiang Y, Liu LS, Shen LP, et al. Traditional Chinese Medicine treatment as maintenance therapy in advanced non-small-cell lung cancer: A randomized controlled trial[J]. Complement Ther Med, 2016, 24: 55-62.

[4] Tang WR, Yang SH, Yu CT, et al. Long-term effectiveness of combined treatment with traditional Chinese medicine and western medicine on the prognosis of patients with lung cancer[J]. J Altern Complement Med, 2016, 22(3): 212-222.

[5] Qi F, Zhao L, Zhou A, et al. The advantages of using traditional Chinese medicine as an adjunctive therapy in the whole course of cancer treatment instead of only terminal stage of cancer[J]. Biosci Trends, 2015, 9(1): 16-34.

[6] Peng ZX, Wang Y, Gu X, et al. A platform for fast screening potential anti-breast cancer compounds in traditional Chinese medicines[J]. Biomed Chromatogr, 2013, 27(12): 1759-1766.

[7] 黄旭晖, 王昌俊. 活血化瘀中药干预肿瘤血管新生的研究进展[J]. 广东医学, 2012, 33(4): 550-552.

[8] 国家食品药物家督管理局. 细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则[J]. 中国新药与临床杂志, 2008, 27(6): 462-465.

[9] Shi W, Siemann DW. Inhibition of renal cell carcinoma angioge-nesis and growth by antisense oligonucleotides targeting vascular endothelial growth factor[J]. Br J Cancer, 2002, 87(1): 119-126.

[10] Takaoka K, Hidaka S, Hashitani S, et al. Effect of a nitric oxide synthase inhibitor and a CXC chemokine receptor-4 antagonist on tumor growth and metastasis in a xenotransplanted mouse model of adenoid cystic carcinoma of the oral floor[J]. Int J Oncol, 2013, 43(3): 737-745.

[11] Chen L, Yuan W, Chen Z, et al. Vasoactive intestinal peptide represses activation of tumor-associated macrophages in gastric cancer via regulation of TNFα, IL-6, IL-12 and iNOS[J]. Int J Oncol, 2015, 47(4): 1361-1370.

[12] 王祥, 徐寒梅. 抗肿瘤动物类中药的研究进展[J]. 药学进展, 2014, 38(6): 432-437.

[13] 单铁英, 潘秀兰, 董静, 等. 三种中药多糖对脑胶质瘤大鼠外周血中CD4+CD25+ T细胞和TGF-I3 水平的影响[J]. 广东医学, 2015, 36(24): 3758-3760.

[14] 李金玉, 李金耀, 张富春. 中药抗肿瘤免疫调节机制研究进展[J]. 时珍国医国药, 2016, 27(7): 1705-1707.

[15] 赵茜茜, 田甜, 闫婉君, 等. 中药干预肿瘤免疫微环境[J]. 现代肿瘤医学, 2016, 24(2): 306-309.

[16] 李秀才. 中药抗肿瘤血管生成的研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2014, 22(8): 1993-1996.

[17] 时百玲, 张玉柱, 周悦, 等. 中药逆转乳腺癌多药耐药的研究概况及展望[J]. 上海中医药杂志, 2016, 50(1): 88-93.

[18] Bian K, Ghassemi F, Sotolongo A, et al. NOS-2 signaling and cancer therapy[J]. IUBMB Life, 2012, 64(8): 676-683.

[19] Kostourou V, Cartwright JE, Johnstone AP, et al. The role of tumour-derived iNOS in tumour progression and angiogenesis[J]. Brit J Can, 2011, 104(1): 83-90.

[20] Zhu W, Yang B, Fu H, et al. Flavone inhibits nitric oxide synthase(NOS) activity, nitric oxide production and protein S-nitrosylation in breast cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2015, 458(3): 590-595.

[21] 叶建红, 刘永莉. 几种活血化瘀中药对血液流变学的影响[J]. 中国中医药信息杂志, 2001, 8(S1): 36.

[22] Roy A, Bera S. CAF cellular glycolysis: linking cancer cells with the microenvironment[J]. Tumour Biol, 2016, 37(7): 8503-8514.

[23] Jiang ZL, Fletcher NM, Diamond MP, et al. Hypoxia regulates iNOS expression in human normal peritoneal and adhesion fibroblasts through nuclear factor kappa B activation mechanism[J]. Fertil Steril, 2009, 91(2): 616-621.

[24] Rus A, Peinado MA, Castro L, et al. Lung eNOS and iNOS are reoxygenation time-dependent upregulated after acute hypoxia[J]. Anat Rec (Hoboken), 2010, 293(6): 1089-1098.

[25] 洪铁, 杨振, 绳娟, 等. 黄芩苷抗肿瘤作用及机制的研究[J]. 中国药理学通报, 2008, 24(12): 1676-1678.

[26] 张伟伟, 陆茵. 丹参抗肿瘤活性成分研究新进展[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(3): 389-391.

[27] Kruspig B, Nilchian A, Orrenius S, et al. Citrate kills tumor cells through activation of apical caspases[J]. Cell Mol Life Sci, 2012, 69(24): 4229-4237.