脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCII)是临床胸、腹主动脉修复术等手术常见并发症，严重者可导致截瘫，甚至死亡[1]，是现代临床医学领域的难题和热点，SCII的防治已成为国际研究的重点。对此，脊髓损伤保护领域提出了许多药物性和技术性的防治措施，其中肢体远程缺血后处理(limb remote ischemic postconditioning，RIP)是在肢体远端非生命器官进行缺血处理，在无创性、简单性、安全性方面都有巨大优势，具有更高的临床应用价值。近年来许多研究已经证实RIP对心、脑、肾等重要器官的缺血损伤均具有保护作用，进一步研究发现其机制与阿片受体的激活密切相关[2-3]。但在脊髓损伤领域，RIP是否对 SCII具有保护作用报道较少，阿片受体是否参与RIP在SCII的作用还鲜见报道。因此2016年10月至2017年5月，本实验通过在兔 SCII模型上观察RIP是否对脊髓具有保护作用，并通过对阿片受体激动剂吗啡(morphine)和阻滞剂纳络酮(naloxone)在脊髓缺血再灌注中的研究，探讨阿片受体在此RIP中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为成年雄性新西兰大白兔，共24只，体重2.0～2.5 kg，由西南医科大学动物实验中心提供；实验试剂：戊巴比妥钠(批号：F20101216，中国医药上海化学试剂公司)，吗啡(批号：101302-9，沈阳第一制药厂)，纳洛酮(批号：H20061215，成都诺迪康生物制药有限公司)；全自动组织包埋机(EG1150，德国Leica)，石蜡切片机(RM2016，德国Leica)，多参数心电监护仪(DASH500，德国普美康公司)。

1.2 方法

1.2.1 SCII模型建立 经耳缘静脉穿刺置管后予3%戊巴比妥钠静脉麻醉后，行耳中央动脉穿刺置管以持续监测心率(heart rate, HR)和近端动脉压(proximal artery pressure，PrAP)；行股动脉穿刺置管监测股动脉压，作为远端血压(distal artery pressure，DAP)。术中用烤灯维持直肠温度于38～39℃。动物取平卧位，自剑突下两横指沿腹正中线剪开皮肤及腹膜，暴露左侧肾脏及腹主动脉，于左肾动脉和腹主动脉分支处向下分离腹主动脉后用血管钳夹闭腹主动脉25 min后再开放，复制兔SCII模型。

1.2.2 分组与实验 24只大白兔随机分为4组，缺血组(SCII组)：按照上述模型建立方法，复制SCII模型。远程缺血后处理组(RIP组)：恢复腹主动脉灌注前2 min，采用婴儿型血压袖带环扎动物双下肢腘窝上1/3，加压至压力达200 mmHg，持续5 min后，松开袖带5 min，如此反复循环3次行RIP操作，其余处理同SCII组。吗啡组(MOR组)：行脊髓缺血操作前10 min经耳缘静脉给予吗啡1 mg/kg，其余操作同RIP组；纳洛酮组(NAL组)：在行脊髓缺血操作前10 min经耳缘静脉给予纳洛酮1 mg/kg，其余操作同RIP组。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 生理学指标 分别于缺血前、缺血15 min和再灌注15 min自耳动脉抽取血样测定血气(PaCO2、PaO2、pH值)及血糖，并观察心率、近端及远端动脉压、直肠温度。

1.2.3.2 神经行为评分 采用改良Tarlov评分法分别于脊髓缺血再灌注后4、12、24、48 h对兔双后肢运动功能进行评分，改良Tarlov评分标准：0分：没有可觉察的下肢活动；1分：有可觉察的关节自主活动；2分：后肢可自由活动但无法站立；3分：可站立但无法行走；4分：后肢功能完全恢复，能正常行走。

1.2.3.3 组织病理学观察 缺血再灌注48 h后，用2%戊巴比妥钠深麻醉动物后，以10%甲醛溶液经心脏灌注固定后取腰段脊髓组织(L5～7)，行石腊包埋后切片(6 μm厚)，HE染色，光镜下(×200)观察脊髓病理学改变并对脊髓前角正常运动神经元计数,计入实验统计的每只动物脊髓前角正常运动神经元数目为3张切片计数的均数。

1.3 统计学方法 数据采用表示，采用单因素方差分析(ANOVA)，多组间两两比较采用SNK检验；后肢运动功能评分组间比较采用非参数秩和检验(Kruskal-Wallis test)，若存在组间差异，采用Mann-whitney U检验。采用Spearman法分析神经功能评分和脊髓前角正常运动神经元计数之间的相关性。

2 结果

2.1 一般资料 在脊髓缺血再灌注过程中血流动力学指标(PrAP、DAP、HR)、直肠温度(T)、血气(PaO2、PaCO2、pH值)及血糖(Gs)在各组内、组间比较均差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

 

表1 生理学参数

  

项目nPrAP(mmg)DAP(mmg)HR(次/min)T(℃)PaO2(mmg)PaCO2(mmg)pH值GS(mmol/L)缺血前 SCII组495±3.095±1.7258±8.738.6±0.2276±1.736±1.07.37±0.026.7±0.2 RIP组494±2.494±1.8263±10.338.6±0.0476±2.038±1.27.37±0.026.8±0.2 NAL组495±1.195±1.8254±10.838.5±0.1277±1.736±1.47.37±0.026.6±0.4 MOR组494±3.694±2.6259±13.638.6±0.1477±1.237±1.27.38±0.016.8±0.3缺血15min SCII组497±2.75.1±1.7257±9.438.5±0.1376±1.136±1.47.38±0.026.7±0.1 RIP组494±2.14.8±1.7262±8.338.6±0.0976±2.038±1.47.37±0.026.6±0.2 NAL组494±1.45.8±1.7257±12.538.5±0.1077±1.538±0.67.38±0.026.7±0.2 MOR组494±2.44.6±2.1259±10.938.5±0.1476±1.237±1.57.36±0.016.8±0.2再灌注15min SCII组495±2.295±2.0263±8.838.6±0.1476±1.536±1.27.38±0.016.6±0.2 RIP组494±2.494±2.8262±8.638.6±0.0575±1.837±0.83.37±0.016.7±0.2 NAL组495±1.295±0.9259±13.038.5±0.0877±1.937±2.07.37±0.016.7±0.1 MOR组493±2.194±2.9258±14.738.7±0.1276±1.238±1.27.36±0.016.7±0.2

2.2 神经功能评分 RIP组再灌后4、12、24、48 h神经功能评分均明显高于SCII组(P<0.05)；再灌注4 h MOR组神经功能评分高于RIP组(P<0.05)，而再灌注12、24、48 h神经功能评分及脊髓前角正常运动神经元计数二者差异无统计学意义(P>0.05)；NAL组再灌注4、12、24、48 h神经功能评分明显低于RIP组(P<0.05)，见表2。

 

表2 再灌注后4、12、24、48 h神经功能评分 M(P25,P75)

  

组别n4h12h24h48hSCII组40.0(0.0,0.0)2.0(1.2,2.0)*0.0(0.0,0.8)0.0(0.0,0.0)RIP组42.5(2.0,3.0)4.0(4.0,4.0)4.0(4.0,4.0)4.0(4.0,4.0)MOR组43.0(3.0,3.8)*4.0(4.0,4.0)4.0(4.0,4.0)4.0(4.0,4.0)NAL组41.5(2.0,3.0)*3.0(2.2,3.0)*2.0(2.0,2.8)*2.0(2.0,2.8)

 

*与同时间点的RIP组比较P<0.05

2.3 组织病理学观察 SCⅡ组、RIP组、MOR组、NAL组的正常运动神经元计数依次为6(5,7)、41(39.75,44.75)、46(44.25,48.50)、24(20.75,27.75)个。RIP组脊髓前角正常运动神经元计数均显著高于SCII组(P<0.05)；MOR组与RIP组之间差异无统计学意义(P>0.05)；NAL组脊髓前角正常运动神经元数均明显低于RIP组(P<0.05)。显微镜下200倍，MOR组和RIP组可见形态正常的脊髓前角运动神经细胞较多，结构完整，胞核偏圆且大，核仁清晰，尼氏体清晰可见；SCII组与NAL组形态正常的神经细胞稀少，胞核固缩变小或溶解消失，胞浆溶解为一片空泡。尼氏体模糊或消失，见图1。

术后复查X线片及CT扫描，按照Matta影像学评估标准：解剖复位2例，满意复位4例，不满意复位2例。所有病例均获得1～2年的术后随访观察。术后1年采用改良的Merle d'Aubigine和Postel评分系统评定髋关节功能：优5例，良2例，可1例。所有患者无神经血管损伤发生，无伤口感染。无1例发生内固定断裂。典型病例见图1。

2.4 再灌注48 h神经功能评分与脊髓前角正常运动神经元计数之间的相关性 采用Spearman等级相关性分析，计算Spearman等级相关系数rS=0.882(P<0.001)，见图2。

3 讨论

自从Murry等[4]首次报道缺血预处理对心肌缺血具有保护效应以来，各种保护重要器官缺血再灌注损伤的缺血前或后的方法因运而生，越来越多的学者开始关注这些技术手段对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。研究发现，行非创伤性双下肢缺血后处理，即利用止血带环扎大鼠双后肢，大鼠心肌在缺血再灌注损伤后，心肌梗死面积减少，减轻了心肌缺血/再灌注损伤程度，随之提出肢体RIP的概念[5]。研究发现，RIP可以减轻心肌、肾脏等重要器官的缺血再灌注损伤[6-7]。在神经保护领域，RIP可以减少局灶性脑缺血大鼠的脑梗死容积[8]。刘铖袆等[9] 在大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型上发现RIP能减轻脊髓缺血损伤，具有神经保护作用。相对于远程缺血预处理来说，RIP的干预是在缺血/再灌注后，更便于掌握时机；相对于缺血后处理而言，其处理对象是远隔的正常脏器或组织而非缺血器官本身，实施更方便可行、更为安全，因而相对于前二者更具有临床意义。

  

A:SCⅡ组；B:RIP组;C:MOR组;D:NAL组

 

图1 显微镜下腰段脊髓再灌注48 h后病理组织切片图

  

图2 再灌注48 h神经功能评分与脊髓前角正常运动神经元计数的相关性

本实验结果显示，RIP能显著提高脊髓再灌注损伤后神经功能评分、减少脊髓前角运动神经元的坏死、增强脊髓缺血耐受能力，对兔脊髓缺血再灌注损伤具有神经保护作用。近年来关于RIP对组织器官缺血再灌注损伤保护作用的机制研究主要集中在细胞受体和细胞通路[10]。相关细胞受体包括阿片受体、三磷酸肌醇(IP3)受体、Toll样受体等，相关离子及信号通路包括K-ATP通路、PI3K通路、ERK1/2通路等。阿片受体于1973年首次发现，研究已经证实体内存在μ、κ、δ、λ等多种阿片受体[11]，各受体广泛分布于中枢神经系统、心血管系统及肾脏、消化道等外周组织。研究报道，κ-阿片受体增强了缺血后处理的心肌保护作用，降低了梗死面积和心律失常的发生率[12]。Fodale等[13]发现阿片受体激动剂能降低脑的缺血再灌注损伤，有明确的保护作用。另有文献[14]报道，心肌缺血再灌注前，给予阿片受体激动剂预处理，可产生同缺血预处理相同效应的心肌保护作用。后研究证实了 IPC的保护效应是通过阿片受体实现的，进一步的研究还发现，吗啡和IPC介导的保护作用的机制是经过同一信号转导途径，包括K-ATP通道蛋白激酶C(PKC)等[15]。因此，我们有理由推测，阿片受体也有可能参与了肢体远程后处理对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。吗啡是阿片受体的激动剂,而纳络酮则是阿片受体的非特异性阻滞剂，本实验结果显示在脊髓缺血前给予纳洛酮，能削弱肢体远程缺血后处理的脊髓保护作用，提示阿片受体参与了肢体远程缺血后处理对兔脊髓缺血损伤的保护作用。给予吗啡后，再灌注早期(4 h)能在肢体远程缺血后处理基础上进一步提高脊髓缺血再灌注早期神经功能评分，但随着脊髓缺血再灌注时间延长，吗啡并不能进一步提高神经功能评分及脊髓后角正常运动神经元数。这可能与吗啡保护脊髓缺血损伤的时间较短，在脊髓再灌注后期，吗啡的作用减弱，未能在肢体远程缺血后处理的基础上进一步增强脊髓，研究证实[16]肢体远程缺血后处理对缺血组织器官的保护机制较为复杂，除了阿片受体的介导，还与K-ATP通道、PKC，减少ROS的形成，减轻细胞脂质过氧化损伤，抑制白细胞的聚集激活、减少炎症介质释放等有关。本试验证实阿片受体参与肢体远程缺血后处理的脊髓保护作用机制,是否也有K-ATP通道、PKC等其他因素共同参与这一机制尚待进一步研究。

综上所述，肢体远程缺血后处理对兔脊髓缺血再灌注损伤具有保护作用；阿片受体阻断剂纳洛酮能削弱肢体远程缺血后处理对脊髓损伤的保护效应，提示阿片受体参与了肢体远程缺血后处理对脊髓缺血再灌注损伤保护作用，可以为临床防治脊髓缺血再灌注损伤提供一种新的手段及研究方向。

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