肝衰竭依然是一个难以克服的世界难题，死亡率高达50%～80%[1]。肝移植是治疗肝衰竭的唯一行之有效的治疗方案[2-6]，但移植肝来源极为困难，生物人工肝(BAL)系统被认为是一个有前途的装置，可暂时维持患者的肝功能并为其等待肝移植赢得一定的时间[7-9]。BAL需要大量的人肝细胞或具有肝功能的细胞[10-12]，因此，同样面临着巨大的困难。第一，没有足够的肝脏来源分离肝细胞，肝细胞又不能在体外培养增殖。第二，猪肝细胞虽获得容易，能替代部分人肝功能，有望成为极具吸引力的选择，但因其逆转录病毒可感染人的风险而被放弃[13]。第三，永生化细胞具有致瘤风险。最后，肝细胞或具备肝功能的细胞系在缺乏特殊的人工细胞外基质(ECM)[14-15]的情况下，趋于丧失其肝脏功能特异性的表达。到目前为止还没有任何细胞系通过了临床应用。因此，为肝脏支持系统寻求一个合适而且健康安全的细胞系迫在眉睫。

Chang Liver细胞被认为是一种人类正常肝细胞系，并通过HeLa细胞建系[16-18]。但是到目前为止，尚无文献报道Chang Liver细胞是否具有肝功能及其在肝脏支持系统中应用的可能性。本研究对Chang Liver细胞的肝特异性功能蛋白及相关基因的表达、肝功能等在体内及体外做了全面的检测。关于Chang Liver细胞能否作为肝脏支持系统的细胞源，本实验做了详尽的探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及药物 MEM、双抗(Penicillin-Streptomycin)、胎牛血清(Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，RT-PCR试剂盒(Fermentas)，ALB兔抗人、CYP3A4鼠抗人和UGT羊抗人多克隆IgG抗体(santa cruz)，荧光二抗(中杉金桥)，Trizol总RNA提取液(Gibco BRL公司)，Chang Liver细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，健康雄性近交系SD大鼠，鼠龄为5～6周，体质量为200～250 g(由华中科技大学同济医学院动物实验中心)。裸鼠，鼠龄为6～8周，体质量为18～20 g(北京华阜康生物科技股份有限公司)。

1.2 仪器及设备 CO2培养箱、激光共聚焦显微镜(Olympus)、共聚焦培养皿、光学倒置显微镜(Olympus)、台式高速离心机(Eppendorf)、多功能酶标仪(BioTek)、UVP凝胶成像分析系统(Bio-Rad)、Western Blot及PCR电泳仪(Bio-Rad)、微量加样器、-80℃超低温冰箱。

1.3 细胞培养 将Chang Liver细胞快速解冻后加入15 mL离心管中，加入少量MEM培养基以去除DMSO的影响，300×g离心去上清，重悬细胞后转入T25细胞培养瓶中，置于37℃、 5% CO2培养箱中。每24 h换液，待细胞长到80%～90%融合后，按1∶3比例传代，细胞扩增到足够数量后进行后续实验。

1.4 Western Blotting 取生长良好的5×106 Chang Liver细胞和原代肝细胞，弃去培养基用PBS冲洗一遍以去除培养基中蛋白的影响，0.25%胰酶消化后收集细胞。加入100 μL细胞裂解液，另加入1 μL PMSF，PMSF的终浓度为1 mM。冰上裂解30 min。10 000×g，4℃离心10 min，取上清提取总蛋白，转移至Ep管中，置于冰上继续后续试验。BCA法测蛋白浓度(按试剂盒说明)。蛋白变性后进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白电泳，分离后通过电转的方式将蛋白质完整转移到硝酸纤维膜，10%脱脂奶粉封闭后分别加入ALB兔抗人、CYP3A4鼠抗人和UGT羊抗人多克隆IgG抗体，以β-actin单克隆抗体为内参照，4℃孵育过夜后用TBST洗膜4次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应IgG二抗，室温孵育1.5 h后用TBST洗膜3次，ECL免疫印迹化学发光试剂放射自显影。采用自动凝胶成像分析系统分析结果。

1.5 RNA提取和逆转录PCR(RT-PCR)反应 取生长状态良好的Chang Liver细胞约1×107，加入Trizol总RNA提取液(Gibco BRL公司)提取总RNA，具体步骤按操作说明。将提取的总RNA用紫外线吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳测定其浓度和纯度。取1 μg的RNA按照逆转录PCR试剂盒(Fermentas)具体说明逆转录合成cDNA。白蛋白(ALB)、凝血因子X(FX)、谷胱甘肽-s-转移酶(GST)和内参照GAPDH基因的上、下游引物序列采用引物设计软件(Primer 5.0)进行设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。ALB上游引物序列为：5′-AAACCTCTTGTGGAAGAGCC-3′；下游引物序列为：5′-CAAAGCAGGTCTCCTTATCG-3′。FX上游引物序列为：5′-GTGCATGGAAGAGACCTGCT-3′；下游引物序列为：5′-GAAGTCAAGCAGGTCGAAGG-3′。GST上游引物序列为：5′ -GCCCTACACCGTGGTCTATT-3′；下游引物序列为：5′-GGCTAGGACCTCATGGATCA-3′。GAPDH上游引物序列为：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；下游引物序列为：5′-AGGTGGTGGGACAACGACAT-3′。PCR热循环反应如下：94℃，5 min；30个PCR循环(94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min)；72℃，5 min。GAPDH作为内参照。cDNA经PCR扩增反应后的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并经UVP凝胶成像分析系统分析结果。

1.6 激光共聚焦 将一定数量的Chang Liver细胞接种于特殊的激光共聚焦培养皿上，待细胞单层铺开后，弃去培养基用温PBS洗两遍。毎皿加入1%多聚甲醛2 mL，室温放置30 min固定细胞。0.1%TritonX-100细胞打孔并置于4℃，20 min。10%二抗来源的血清37℃封闭1 h，以封闭非特异性结合。一抗1∶100稀释后4℃孵育过夜(抗体与Western Blotting所用一抗一致)。荧光二抗1∶200用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)稀释37℃避光孵育30 min(ALB二抗为FITC标记的羊抗兔IgG，CYP二抗为TRITC标记的羊抗鼠IgG，UGT二抗为TRITC标记的兔抗羊IgG)。每两步操作间用温PBS洗两遍。甲醇洗一遍，洗掉多余未结合的DAPI。共聚焦培养皿中加入少量PBS，激光共聚焦显微镜下观察Chang Liver细胞ALB、CYP3A4和UGT的表达和分布情况。

1.7 ALF动物模型及标本采集检测 选择雄性健康近交系SD大鼠，鼠龄为5～6周，体质量为200～250 g，饲养温度28℃，湿度为40%～70%，正常饲料喂养至300 g左右，随机抽取，乙醚吸入麻醉，消毒开腹，充分暴露肝脏(不满意时可剪断剑突)。剪开肝镰状韧带至下腔静脉前，挤出肝脏，剪断肝胃韧带和部分冠状韧带，游离左外叶。1号线绕过左外叶于肝脏膈面根部结扎，剪下左外叶。同时抬起肝脏左內叶和中叶，脏面绕线，膈面根部结扎，一起剪下。至此已完成70%肝脏切除术。同样方法切除右外叶和三角叶，仅保留肝尾状叶，完成90%肝切除术。清除腹腔内积血，逐层关腹。术后适量补液，腹腔注射抗生素。实验组术前1天开腹并脾内注射5×107 Chang Liver细胞重选液(500 μL MEM重悬)(n=10)，对照组注射等量的MEM培养基(n=10)。两组的血液标本分别于术后0、24、48、72、96、144 h收集并交实验室检测肝功能指标，包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆红素、碱性磷酸酶等。并分别计算和统计两组生存率。

1.8 统计学处理 应用SPSS 15.0软件进行分析，计量资料采用表示，采用配对样本t检验法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Chang Liver细胞形态学表现 Chang Liver细胞在含有1×非必须氨基酸、1 mmol/L丙酮酸钠、10%胎牛血清和双抗的MEM培养基中培养。其细胞数从2.5×106 增长至5×107一般只需要3天时间，说明Chang Liver细胞具有良好地增殖能力。显微镜下Chang Liver细胞为梭形，贴壁、上皮样细胞(图1)。

A为倒置显微镜下100倍Chang Liver细胞形态学特征；B为200倍形态学特征

图1 Chang Liver细胞形态学表现

2.2 Western Blotting 检测肝功能标志性蛋白表达 正常肝细胞和Chang Liver细胞均表达肝功能标志性蛋白ALB、CYP3A4和UGT，且其表达量并没有明显的差别(图2)，β-actin为内参照。

图2 Western Blotting 检测肝功能标志性

蛋白ALB、CYP3A4和UGT的表达

2.3 Chang Liver细胞相关基因的表达 提取总RNA经RT-PCR反应后扩增，琼脂糖凝胶电泳显示Chang Liver细胞在mRNA水平除表达ALB外还表达GST，但并不表达FX，GAPDH作为内参照。Chang Liver细胞的肝细胞功能在mRNA水平得到证实(图3)。

图3 RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳显示Chang Liver细胞

mRNA水平表达ALB和GST

2.4 激光共聚焦下Chang Liver细胞蛋白表达 激光共聚焦显微镜下可清晰看到Chang Liver细胞内ALB、CYP3A4和UGT的表达情况。ALB在蓝光激发下显示为绿色荧光，可看到其均匀分布于细胞的胞浆内(图4A)。CYP3A4(图4B)和UGT(图4C)为橘红色荧光分布于胞浆内。细胞核为DAPI染色，在紫外线激发下为蓝色荧光(图4D)。结果进一步证实Chang Liver细胞的肝细胞功能。

A为ALB(FITC标记，×100)； B为CYP3A4(TRITC标记，×100)；C为UDT(TRITC标记，×100)；D为DAPI染细胞核。

图4 激光共聚焦显微镜下Chang Liver细胞蛋白表达情况

2.5 大鼠急性肝衰竭后生存率变化 实验组(G2)大鼠90%肝切除术前1天脾脏内移植Chang Liver细胞，对照组(G1)输注等量MEM培养基。肝切除术后，对照组24 h生存率为40%，其平均存活时间仅为3 d。实验组的生存率得到了明显的改善(24 h生存率为80%，48 h为60%，72 h为50%，长期生存率为40%)。对照组则3天内全部死亡。结果说明Chang Liver细胞可明显改善ALF后的肝功能(图5)。

G1：对照组；G2：实验组，术前移植Chang Liver细胞

图5 两组大鼠90%肝切除术后生存率变化

(P=0.0078 <0.01 for G2 vs.G1)

2.6 实验室检测肝功能变化 血液标本由术后0、24、48、72、96、144 h存活的大鼠体内获得，送实验室检测肝功能指标。结果显示实验组与对照组肝功能指标存在差异。术后24 h，实验组的ALT、AST、胆红素及ALP均明显低于对照组(图6)。这也是Chang Liver细胞在体内发挥肝脏功能的直接证据。

3 讨论

急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)是一种非常凶险的肝脏疾病并伴随着很高的死亡率，目前可根治急性肝衰竭的唯一方法是肝移植。然而供肝的数量远远不能满足移植患者的需求，很多急性肝衰竭患者在等待肝移植的过程中死亡。除肝移植外，尚有两种行之有效治疗方法，即肝细胞移植和生物人工肝。作为急性肝衰竭患者接受肝移植前的一种过渡性治疗措施，其可暂时维持肝脏功能并为自身肝脏的修复赢得一定的时间。但肝细胞移植和生物人工肝都需要大量的肝细胞，目前原代肝细胞的来源十分困难，主要是可供分离肝细胞的肝脏来源不足，且原代肝细胞体外培养增殖极为困难。大量实验研究表明，急性肝衰竭后因为大量肝脏组织的坏死和肝功能的丢失，导致大量毒性物质的堆积[19]。其中的某些物质甚至会抑制肝脏细胞的再生，进而形成一种恶性循环，加重肝脏功能障碍[20]。另有研究表明，肝衰竭患者的血浆成分在体外可影响正常肝细胞的形态、生长、凋亡[21]及细胞功能[22-23]，包括抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等[24-25]。细胞色素酶P450(CYP)和葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)是细胞代谢中的关键酶，而CYP3A4在肝脏内为更为关键的亚型[26]。

本实验中发现Chang Liver细胞在功能上与正常肝脏细胞相似。肝脏功能主要包括分泌、排泄和解毒等功能。而肝脏的合成分泌功能中以合成白蛋白为主，因此本实验中选取ALB作为细胞合成分泌功能的主要检测指标。根据肝脏特有的酶系统，将其分为两型，即相Ⅰ反应(通过氧化、还原、羟化、硫氧化、去胺、去羟化或甲基化等生物化学反应)和相Ⅱ反应(如微粒体的二磷酸尿核苷葡萄糖转移酶促使某些物质与醛糖酸结合生成醛糖酸盐，便于从胆汁和尿中排出)。而CYP3A4和UGT恰好分别是这两方面的代表，因此实验中选取其作为肝脏解毒功能的检测指标。在体外实验中，结果显示Chang Liver细胞表达肝脏功能特异性蛋白ALB、CYP3A4和UGT。为了避免实验设计中的重复性，便于从多方面证明Chang Liver细胞的肝细胞功能，基因水平RT-PCR选取GST和FX等作为Chang Liver细胞的功能检测指标。RT-PCR的结果证实Chang Liver细胞在mRNA水平上表达肝细胞功能的相关基因，如ALB和GST。并且在这些肝细胞功能特异性蛋白及相关基因的表达上，Chang Liver细胞与正常肝细胞无明显差异。激光共聚焦也同样清晰的显示了相关蛋白的表达。以上均表明Chang Liver细胞具有良好的肝细胞功能。

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A B

C D

sham为相应指标的正常值，n=5；G1为对照组，n=10；G2为实验组，n=10；*：P<0.05)A为谷丙转氨酶(ALT)；B为谷草转氨酶(AST)；C为总胆红素(TBIL)；D为碱性磷酸酶(ALP)。

图6 实验组与对照组90%肝切除术后肝功能指标变化情况

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考虑到Chang Liver细胞的潜在成瘤性，将Chang Liver细胞注射到大鼠脾脏实质内，Chang Liver细胞可以成功的存活下来并发挥其肝脏功能。由于大鼠的正常免疫功能屏障作用，随着肝脏的再生，Chang Liver细胞被排斥清除。Chang Liver细胞在ALF期间起到了至关重要的作用，在为自身肝脏细胞的修复赢得时间的同时并没有肿瘤的形成。鉴于Chang Liver细胞的潜在成瘤性，其将不能被用作肝细胞移植。但其良好地肝功能提示可为生物人工肝等肝脏支持系统提供细胞来源。除此之外，已有某些报道称，具备肝脏功能的肿瘤细胞通过特殊的隔离装置也可被用作生物人工肝[27-29]。

为了进一步验证Chang Liver细胞的整体肝功能和其对抗急性肝衰竭的能力。在体内实验中采用大鼠90%肝切除术建立急性肝衰竭模型并于术前1天脾脏内移植Chang Liver细胞来验证其效果。实验结果显示，Chang Liver细胞对急性肝衰竭有明显的保护作用。移植了Chang Liver细胞的大鼠在90%肝切除术后长期生存率为40%，而对照组为0。再者，移植了Chang Liver细胞的大鼠在90%肝切除术后肝功能也较对照组有明显的好转。ALT、AST、胆红素和ALP等随时间延长均降至正常值水平。Chang Liver细胞的肝功能同样在体内得到了充分的证明。

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综上所述，本实验证明了Chang Liver细胞具备良好地无限增殖能力，容易满足肝脏支持系统所需的细胞量。并且可明显改善急性肝衰竭大鼠的肝功能，延长生存率。Chang Liver细胞可作为一种新的细胞源为肝脏支持系统及其他肝脏研究提供细胞来源。

参 考 文 献

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