病原性海洋弧菌是一群在海洋环境中常见的，广泛分布于内海、沿岸、海水沉积物[1]和海洋生物体中，可感染海洋生物或者人类[2]，引起人类爆发性食物中毒的一类条件致病菌。已报道过的海水养殖动物病原弧菌有20多种，而某些种类的弧菌也可以导致人或者其他动物发病，尤其以霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌[3，4]为重要的食源性弧菌。创伤弧菌可经口感染或者皮肤伤口感染，对人群机会致病，导致人群致死性创伤感染及脓毒血症的发生，病死率高达50%以上[5]。而溶藻弧菌为条件致病菌，通过水产品感染人类，引起急性腹泻和食物中毒[6]，近年来时有文章报道。但是，由于海洋性弧菌的培养要求较高，针对此类致病菌的实验室鉴定方法比较复杂，急需一种简单易行的方法。本研究尝试建立一种可同时检测创伤弧菌与溶藻弧菌且特异性强、灵敏度高的多重降落PCR方法，希望可以用于临床粪便标本的检测，为食源性疾病诊断提供技术支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 标本收集 收集我院20l7年1月至2017年12月的就诊腹泻患者粪便标本进行鉴定分析，并对其中的93份标本用所建立的体系进行验证。

1.1.2 标准菌株 实验用创伤弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌标准菌株均由山东大学(威海)海洋学院提供。质控菌株为我院实验室常规保存质控菌株。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集送检 对疑似食源性疾病患者，分别用无菌棉拭子多点采集新鲜粪便标本，如有脓血或粘液部分，液体粪便应取絮状物，插入运送培养基内，拧紧管口，立即送实验室检测。

1.2.2 标本处理 根据《全国临床检验操作规程》第3版进行菌株的培养及对分离菌株进行细菌鉴定分析。将采集标本的拭子放入3%氯化钠碱性蛋白胨水中，于(36±1)℃培养8～16 h，然后接种TCBS平板，(36±1)℃培养18～24 h，挑取疑似菌落进行鉴定。

1.2.3 细菌的鉴定

1.2.3.1 菌株的常规鉴定 对分离菌株常规进行细菌分析，包括菌落特点、染色和镜下形态，以及生化反应。鉴定采用法国生物梅里埃VITEK-2 Compact 全自动微生物分析仪操作。

1.2.3.2 16SrRNA基因序列分析鉴定菌株 于培养基上挑取单个菌落放入50 μL抽提裂解液中，充分混匀，100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清PCR分析。PCR扩增选用细菌16SrRNA基因序列通用引物[7]，P1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P2: 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应条件为：94℃5 min，(94℃1 min，60℃30 S，72℃1 min)×30循环，72℃延伸10 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。将PCR 产物直接送于北京擎科生物技术有限公司完成序列的测定，DNA 测序结果经BLAST后与GenBank数据库菌株比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，结合相关生化反应进行待测菌株的鉴定。

1.2.4 引物设计 应用Primer-BLAST软件对创伤弧菌vvhA基因和溶藻弧菌的toxR基因，内参16S rDNA的基因设计特异性引物，应用 Primer-BLAST 检测所设计引物的特异性。引物序列见表1。

表1 多重降落PCR的引物序列[8]

目的基因引物序列目的片段大小创伤弧菌vvhAF：GTTTTACTCCTGACGCCAAAATTGTCR：GCGAATACGTTGTTTCACAGTACTG740bp溶藻弧菌的toxRF：CAACTCATTTGTTCAGTGGAACGCR：TACRCAAAYAGGAAGCAGYAGAG246bp内参16SrDNAF：CAGCAGCCGCGGTAATACGR：GCTCGTTGCGGGACTTAACC598bp

1.2.5 细菌DNA的提取 将培养出的标准菌株细菌收集到含生理盐水的试管里，混匀离心收集沉淀。使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书提取DNA。提取出来的DNA保存于-20℃备用。

1.2.6 单一降落PCR PCR扩增总体系25 μL，含(10×PCR)缓冲液2.5 μL，MgCl2 (25 mM) 3 μL，dNTP (10 mM) 1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2 μL，提取的标本基因组DNA 1 μL，体系中引物量分别为vvhA 0.3 μL，toxR 0.2 μL，16SrDNA 0.1 μL，同时设阳性模板对照与阴性对照(双蒸水作为模板)。反应条件：94℃8min；94℃40 s，65℃(每循环降低0.5 ℃)25 s，72℃60 s，20个循环；94℃40 s，55℃25 s，72℃60 s，20个循环；72℃8 min。

1.2.7 多重降落PCR 多重降落PCR体系中同时含有两种特异性引物与16S内参，反应条件和反应体系与单一降落PCR相同。PCR产物于2%琼脂糖凝胶6 V/cm恒压电泳，0.5 mg/L溴化乙锭溶液染色，在凝胶成像仪下分析电泳结果。

1.2.8 检测下限的确定 提取的细菌基因组DNA使用无菌水进行倍比稀释，稀释度为101～107，以此稀释模板按上述进行PCR试验，将产生特异可见条带的最低细菌基因组DNA浓度定义为该多重降落PCR的检测下限。

1.2.9 临床标本验证 以细菌培养法作为参考方法，使用93份粪便标本验证所建立的多重降落PCR用于临床检测时的特异性与灵敏度。

2 结果

2.1 海洋性弧菌检出情况 2017年1月—2017年12月，我院共采集疑似食源性疾病患者粪便422例，检出致病菌106例，阳性率为25.12%。其中检出海洋性弧菌45例，占致病菌总检出率的42.45%，其中副溶血性弧菌25例，创伤性弧菌8例，溶藻弧菌5例，其它7例。具体见表2。

表2 食源性疾病海洋性弧菌检出及分布情况

菌种总数副溶血弧菌创伤性弧菌溶藻弧菌其它弧菌例数4525857阳性比/%10055．5517．7811．1115．56

2.2 单一降落PCR 各单一PCR均可扩增出特异性条带，检测样本出现740、246 bp条带中的任意1条则代表所对应的标本中有相应致病菌检出，16SrDNA的598 bp作为内参。结果见图1。

式中，μi为土地利用经济效益系数，定义为各类用地单位面积生产总值的多年GM(1,1)预测平均值，时间范围以SD模型时间边界为准，即μi=(2155.522,3.987,0)，单位为万元 /hm2。

图1 单一降落PCR可扩增出的特异性条带

2.3 多重降落PCR

2.3.1 引物特异性检测 同时检测了几种其它菌属质控菌株及标准菌株，携带相应基因的菌株于740、246 bp条处出现对应大小的条带，其它细菌基因组模板及阴性对照无条带出现，结果见图2。

泳道1、4、6、7为阴性结果，泳道2、5为溶藻弧菌，泳道8、9为创伤弧菌，泳道3为创伤弧菌和溶藻弧菌，M为DNA Marker，自上而下依次是1000、700、500、400、300、200和100 bp，泳道10为阳性对照，自上而下依次是740、568和264 bp。

图2 同时PCR检测几种其它菌属质控菌株及标准菌株出现的条带

2.3.2 检测限的确定 利用建立的多重降落PCR对两种致病菌基因DNA进行检测限检测，检测下限分别为104 CFU/mL、103 CFU/mL。结果如图3。

2.4 临床标本验证 以细菌培养法为参考标准时，多重降落PCR检测创伤弧菌的灵敏度与特异性分别为100%、96.47%，检测溶藻弧菌的灵敏度与特异性分别为100%、95.45%，总灵敏度与特异性分别为100%、95.95%，见表3。

M为DNA Marker，自上而下依次是1000、700、500、400、300、200和100 bp，泳道1～7分别是107、106、105、104、103、102和101 CFU/mL

图3 多重降落PCR对两种致病菌基因DNA进行检测限检测

表3 建立体系的灵敏度和特异性分析结果

检出菌种多重降落PCR培养法/n阳性+阴性-灵敏度/%特异性/%创伤弧菌阳性+83阴性-08210096．47溶藻弧菌阳性+54阴性-08410095．45

3 讨论

海洋弧菌广泛存在于水生环境中，数量丰富，不仅对水产养殖业影响巨大，对人类健康也可造成极大的危害。威海地处渤海湾与黄海交界处，水域面积大，海洋细菌分布广[9]。因此对弧菌快速准确的检测，能够有效的监测水产养殖环境中的病原弧菌及减少食品安全事故的发生，同时也是防御和治疗的关键。而传统的检测方法在不同程度上存在耗时长、检出率低、敏感性或特异性不高等特点，对标本很难在短时间做出全面准确的诊断，严重影响临床诊断与治疗，所以我们需要一种快速检测的方法。

多重PCR则可以根据致病菌的毒素基因、高度保守基因及特异性基因等方面，设计合成多对引物，建立与优化多重PCR反应体系[10]，通过运用不同的引物、模板和引物的浓度以及其比例、Mg2+浓度、dNTP浓度、循环参数等众多影响因素，就可以有效的解决单一PCR产物的非特异性结合及引物与模板的结合率低等相关问题。在既保留了单一PCR的特异性，且又显著提高了检测的灵敏度的同时，又减少了操作步骤与试剂，有效的实现了一次扩

增的同时可检测多种病原微生物的目的。近年来对此类的研究亦有相关报道[11]。但是很少有报道关于在临床标本中进行相关检测与验证。

本实验通过建立与优化的多重降落PCR的体系，具有操作简单、检测时间短、灵敏度高和特异性强的优点，与常规细菌的检测相比，具有很大的优势，有很强的应用价值和较好的前景，可以有效地指导临床对相关疾病的诊断与治疗[12，13]。

5） 用户热水系统：本系统是将20℃的水由供水增压泵引出，输入到板式换热器B与经板式换热器A换出96℃的热水换热后，产生的热水进入热水储罐，作为用户热水。当水温低于设计值90℃时，由回水泵将热水从热水储罐中输送回板式换热器B继续吸热，直到水温达到设计值90℃时停止。

参 考 文 献

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