肺癌是世界癌症相关死亡的主要原因，占所有癌症相关死亡的21.7%[1]。加强肺癌的早期筛查，进而进行早期干预，可显著改善肺癌患者的预后[2]。在中国，肺癌的早期筛查工作还存在诸多问题，有限的生物标志物、不敏感的诊断技术是多数晚期非小细胞肺癌患者不理想临床结果的主要因素。近年来，肺癌的表观遗传学机制引起国内外学者的广泛关注，DNA甲基化被认为是较好的研究表观遗传学变化的标志物[3]。在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的研究中，发现O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methylotrans,MGMT)DNA 甲基化与肿瘤性转化有关，推断其可能成为潜在的生物标志物，用于临床相关性诊断、治疗和预后判断[4]。本研究基于这一理论基础，对比研究NSCLC患者支气管肺泡灌洗液(BALF)、血清、癌组织中O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methylotrans，MGMT)基因甲基化表达水平，探讨利用BALF 中MGMT基因甲基化检测作为NSCLC诊断有效辅助生物指标的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年12月至2017年5月于宁夏自治区人民医院总院呼吸内科、心胸外科因肺部疾病住院手术患者98例为研究对象。分为试验组(手术后经病理检查确诊为NSCLC的患者)63例和对照组(慢性阻塞性肺疾病肺大泡切除术、支气管扩张患者、肺部良性结节等患者，手术后病理检查排除肺部恶性肿瘤)35例。排除标准为：术后病理为小细胞肺癌者；有其他系统肿瘤史；有放、化疗等其他治疗者。试验组中，男27例，女36例；平均年龄为(59.2±7.3)岁；病理类型：鳞状细胞癌19例，腺癌32例，腺鳞癌9例，大细胞癌 3例；按2009版IASLC分期方法进行分期，术后临床分期为Ⅰ、Ⅱ期者，其中Ⅰ期患者14例，Ⅱ期患者为49例。对照组中，男26例，女9例；平均年龄为(67.7±5.4)岁；慢性阻塞性肺疾病继发肺大泡患者13例，肺部炎性假瘤患者6例，肺曲霉菌病2例、肺结核患者9例，肺脓肿患者3例，支气管扩张患者2例。所有患者均签署知情同意书。

1.2 标本来源及预处理

1.2.1 BALF标本 所有患者于治疗前行电子支气管镜检查，在常规支气管镜检查后，用生理盐水100 mL(分5次)对肺CT提示病变部位所对应的相应叶段行灌洗，并立即回收，回收量约40～50 mL，以无菌双层纱布过滤后，离心15 min，分离BALF细胞与上清液，分别置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 血清标本 所有患者于入院次日凌晨空腹采集外周静脉血5 mL，4℃静置2 h，3 000 rpm离心10 min，分离获得血清标本，-80℃冰箱保存。

1.2.3 肺组织标本 收集试验组或对照组手术切除的肺癌组织或炎性肺组织，置于消毒EP管中，-80℃冰箱保存。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA的提取 用酚氯仿法分别提取BALF细胞和上清液的DN A并进行定量分析。肺癌组织、良性肺组织DNA提取按照DNA纯化试剂盒(上海生物工程公司)提取样本中的基因DNA，操作步骤按说明书进行。血清DNA采用QIAamp Blood Mini Kit DNA抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取。提取后用琼脂糖凝胶电泳和紫外线分光光度仪检测纯度及含量。

1.3.2 DNA的修饰与纯化 使用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold对提取的DNA进行甲基化修饰。回收修饰后的DNA重悬于去离子水中，用于甲基化特异性PCR。

1.3.3 甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP) 按照甲基化和非甲基化DNA序列的改变，设计两对引物(由北京博奥生物科技有限公司合成)，用于扩增MGMT基因甲基化和非甲基化的基因，产物长度分别为81和93 bp。甲基化引物：上游5c-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3c，下游5c-CACTCTTCCGAAAACGAAACG-3c。非甲基化引物：上游5c-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3c，下游5c-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3c。PCR反应体系总体积为50μL。反应条件为：95℃预变性3 min；95℃1 min，特定退火温度1 min，72℃1 min，×35个循环；72℃延伸50 min。以经SssI 酶处理的和未经SssI 酶处理的正常人外周血淋巴细胞DNA分别作阳性和阴性对照，不含DNA的蒸馏水作为空白对照。

1.3.4 结果判定 PCR结束后，制备含溴化乙锭0.5 g/mL的3%琼脂糖凝胶。每孔加样6μL，电泳缓冲液为1×TAE。停止电泳后，紫外检测仪下观察并拍照。甲基化特异性引物(M)扩增出目的条带、甲基化特异性引物(M)及非甲基化特异性引物(U)均扩增出目的条带，判定为基因甲基化；非甲基化特异性引物(U)扩增出目的条带，而不出现M条带扩增，判定为基因未甲基化。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行统计分析。采用fish精确检验法比较对试验组和对照组中MGMT基因甲基化水平是否存在差异；采用配对四格表法分别比较肺癌组织中、BALF中以及血清中MGMT基因甲基化水平有无差异。

2 结果

2.1 不同来源标本MGMT基因甲基化率 NSCLC患者肺癌组织中MGMT基因甲基化发生率为58.7%(37/63)，BALF中MGMT基因甲基化发生率为52.4%(33/63)，血清中MGMT基因甲基化发生率为27.0%(17/63)。所有BALF、血清中检测到MGMT异常甲基化的患者，其肿瘤组织也能检测到该基因的异常甲基化(见图1，表1)；肺癌组织中MGMT基因异常甲基化者，部分可出现BALF、血清的MGMT异常甲基化表达。

配对检验结果表明，肺癌组织的MGMT基因甲基化率与BALF 中该基因的甲基化率存在着较好的一致性(P>0.05)，见表2；而血清标本中该基因的甲基化一致性较差，其判断肿瘤良恶性的敏感度低于BALF标本。另外，35例肺良性病变对照组的肺组织标本、BALF及血清标本，均未检测到MGMT基因甲基化表达，其甲基化率为0(见表1)。

图1 NSCLC患者不同标本来源MGMT的表达

表1 试验组和对照组血清、肺泡灌洗液及组织中甲基化比较

分组试验组对照组P肺癌组织MGMT基因甲基化370MGMT基因未甲基化2635<00001血清MGMT基因甲基化170MGMT基因未甲基化46350．0004BALF⁃MGMT基因甲基化330MGMT基因未甲基化3035<00001

表2 试验组BALF与血清中MGMT基因甲基化比较表

标本类型癌组织甲基化(+)癌组织甲基化(-)χ2值PBALF甲基化(+)330BALF甲基化(-)42648．70<005血清甲基化(+)170血清甲基化(-)202616．36<005

2.2 MGMT甲基化状态与组织学类型的相关性NSCLC患者BALF、血清、癌组织标本中MGMT基因甲基化状态与患者组织病理学类型相关(P<0.05)，但进一步计算person列联系数C=0.4824，考虑C仍较小，虽有统计意义，但可以认为两者关联不大(表3)。

表3 MGMT甲基化状态与组织学类型的相关性

病理分型肺癌组织灌洗液血清χ2值P鳞癌1092腺癌181110鳞腺癌6104大细胞癌33126．39<0005

3 讨论

众所周知，肿瘤的发生与DNA的破坏密切相关，而DNA的破坏系其修复和破坏的平衡遭到破坏所致。研究表明：某些特殊基因启动子甲基化水平的检测，可以不仅可以显著提升肿瘤早期诊断的水平[5]，也可以评估肿瘤对分子靶向药的耐药机制，评估肿瘤复发风险[6]。MGMT是真核细胞中较为重要的DNA修复酶，它的编码基因启动子甲基化是导致肿瘤发生的重要原因之一；Meta分析也发现，在胃癌的发生中也存在MGMT甲基化的显著增多[7]。且MGMT启动子的甲基化，在NSCLC患者中较为特异，而正常组织中却少有MGMT启动子的甲基化，这已经被De[8]等人的研究所证实。本研究中，所有非NSCLC病例中，无论组织标本、血清标本，抑或是BALF标本中，均未能发现有MGMT启动子的甲基化，提示MGMT启动子甲基化水平特异性良好，可以作为评估患者肿瘤风险的良好指标之一。

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本研究发现，NSCLC患者癌组织中MGMT甲基化率58.7%；国外Brabender等[9]对90例NSCLC患者检测后发现，MGMT基因甲基化率38%；Safar等[10]检测了NSCLC的IA期患者，其MGMT基因甲基化率只有11%，考虑到我们所选取的患者多系出现明显气短症状后就诊发现肺部肿物，病灶较大产生压迫症状，因此推测患者所处不同时期造成了MGMT基因甲基化率的差异。另外，本研究发现，在NSCLC患者BALF中，MGMT基因甲基化率为52.4%；Millares等[11]报道，肺鳞癌患者痰液中存在MGMT基因甲基化，提示BALF中MGMT基因甲基化水平对诊断肺癌有良好的预测价值，但因本研究取材有限，BALF对于肺癌的预测价值仍有必要扩大样本量继续研究。本研究中NSCLC患者血清中MGMT甲基化率27%，而非NSCLC患者血清中MGMT基因的甲基化率为0，该结果与国内学者研究结果[12]一致，提示血清中MGMT甲基化的检测可以作为最简便的排除肿瘤的筛查手段。

本研究发现，NSCLC患者BLAF中的MGMT甲基化水平与肺癌组织中该基因的甲基化水平有较好的一致性，而血清中MGMT的甲基化水平与肺癌组织中该基因的甲基化水平一致性差。考虑可能原因在于BALF针对受检者病变呼吸道取材，含有下呼吸道的脱落细胞和DNA片段更为丰富，这无疑为利用支气管肺泡灌洗液进行肺癌分子生物学诊断奠定了基础。在肺癌的高发区，长期暴露于煤炭烟雾刺激下的人群，较之常人，其气道分泌物中某些肿瘤相关基因启动子甲基化率明显升高，且由于获取到直接来源于肺癌组织脱落DNA的机会大，因而其可靠性、敏感性、特异性明显高于血清标本，该结果亦本研究结果一致，提示BALF中MGMT基因甲基化的检测可能成为筛查肿瘤患者较为敏感的检测手段。

两组患者均顺利手术，无血管、神经损伤等严重并发症。手术时间钩板组为（83.61±13.15）min，复合组为（86.19±13.22）min，两组间差异无统计学意义（t=-0.610，P=0.546）。术中失血量钩板组为（61.11±26.77）ml，复合组为（69.52±24.59）ml，两组间差异无统计学意义（t=-1.020，P=0.313）。钩板组术后早期1例伤口红肿、经积极换药等处理后愈合良好；复合组无切口感染或血肿，切口均一期愈合。

综上所述，本文初步探讨了支气管肺泡灌洗液中肿瘤相关基因MGMT甲基化检测在NSCLC筛查诊断中有一定的临床应用价值，该筛查手段与肺癌组织中该基因的甲基化水平有良好的一致性，且检测更为方便，相对于获取肺癌组织来说，获取标本的难度明显降低，有助于患者的早期筛查，进而提高临床诊断率，从而尽早治疗，改善部分患者的预后。

参 考 文 献

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5.神经功能评分和建模成功的标准：家兔在缺血后6 h行神经功能评分，参照Longa神经功能缺失评分法[6]。0级为正常，1级为不能完全伸展左侧前肢，2级为向左侧转圈，3级为向左侧倾倒，4级为无自主活动并伴意识障碍。建模成功的标准：(1)缺血6 h神经功能缺损评分≥2级。(2)TTC染色证实大脑中动脉供血区缺血。