糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并发症之一，最终导致终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)，是2型糖尿病的主要死因之一。但DN发病机制复杂，涉及多种病理生理过程，至今尚未研究清楚。研究证实，内皮细胞转分化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是参与早期DN肾脏纤维化发生发展的重要病理生理机制之一[1], 而转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可促进EndMT发生，导致DN肾脏纤维化[2]。近年来，新发现的一种脂肪因子Chemerin及其受体ChemR23被证实与TGF-β1相关[3]，在多种病理生理过程中参与器官的纤维化，因此我们推测Chemerin与其受体结合后，通过TGF-β1参与EndMT并促进DN肾脏纤维化的发生发展。而Chemerin/ChemR23与EndMT是否相关未见报道，因此本研究利用DN患者血清及肾组织标本研究Chemerin/ChemR23与EndMT的相关性，为延缓DN肾脏纤维化的进展提供治疗思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料 随机选取2016年4—12月在郑州大学第一附属医院确诊的DM无肾病患者(DM组)20例，其中男10例，女10例，平均年龄(53.26±3.25)岁，DN患者(DN组)60例(分为3组，A组：UACR为30～300 mg/g，eGFR≥60 ml/(min·1.73 m2)的患者20例；B组：UACR>300 mg/g，eGFR≥60 ml/(min·1.73 m2)的患者20例；C组：UACR>300 mg/g，eGFR<60 ml/(min·1.73 m2)的患者20例，每组男女比例均为1∶ 1，平均年龄为A组(52.34±4.53)岁，B组(54.42±3.12)岁，C组(53.36±3.96)岁，纳入患者分别符合1999年WHO制定的糖尿病的诊断标准及Mogenson糖尿病肾病诊断分期标准。以同期无糖尿病、高血压、肾脏病及内分泌疾病等的20例健康体检者为对照(NC组)，其中男10例，女10例，年龄为(54.63±3.18)岁。DN患者行肾穿刺活检者共8例，其中男4例，女4例，平均年龄(53.62±4.51)岁；以10例肾癌根治术后患者的肾组织标本(距离癌组织5 cm以上)作为对照，男5例，女5例，平均年龄(54.69±2.98)岁。排除标准：原发或继发性肝肾疾病、ESRD行肾脏替代治疗者、伴有其他内分泌疾病、严重感染。所有入组人员签署知情同意书。

竭诚服务职工群众。群众利益无小事。只有平时真正把职工群众的一桩桩“小事”做好了，做到与职工群众心连心，关键时刻才能“一呼百应”。要大处着眼、小处着手，不怕琐细、日积月累，深入细致做好为职工服务工作。要深入开展农民工入会集中行动，最大限度把农民工吸收到工会中来，使他们成为工人阶级坚定可靠的新生力量。要坚持扶贫同扶志、扶智相结合，分类做好城市困难职工解困脱困工作，让困难职工同步迈入全面小康社会。

1.2 治疗方法

1.2.1 血清标本收集 收集所有入选者血液5 ml，以3 000 r/min离心15 min，留取上层血清，置于-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.3 统计学分析 应用SPSS 22.0统计学软件对所获得的数据资料进行统计学分析，定量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验；Spearman方法进行数据间的相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

(4)胴体由预冷池依次滑出，由后区相关实验责任人对每组胴体进行分割，要求每组分割的产品种类相同，价格相同。并且要求对实验鸡只的分割安排工作要做到专人专职。即相同的工作必须同一个人做，比如：链条割翅割腿、大胸分级修剪、剔骨切块等。同时，专人对所有的实验数据进行汇总分析工作，统计不同只重对产品出成和综合售价的影响。

1.2.2 检测试剂 采用伊莱瑞特生物科技有限公司生产的Chemerin及TGF-β1 试剂盒，应用美国Thermo多功能酶标仪(VARIOSKAN LUX)进行检测，实验步骤严格按照说明书要求进行。使用中杉金桥公司的免疫组化试剂盒，Santa公司的羊抗人Chemerin多克隆抗体、巴傲得公司的兔抗人ChemR23多克隆抗体、Abcam公司的兔抗人α-SMA及羊抗人CD31多克隆抗体，以及北京鼎国昌盛生物技术公司生产的HRP标记的小鼠抗兔、驴抗羊二抗，通过免疫组化技术检测肾组织Chemerin/ChemR23、α-SMA及CD31的表达。

2 结果

2.1 DM组与DN组、NC组血清Chemerin、TGF-β1表达水平 与NC组相比，DM组、DN-A组、B组、C组血清中Chemerin表达升高(P<0.05)；与DM组相比，DN-A组、B组、C组Chemerin表达升高(P<0.05)；且随病情进展，Chemerin表达呈进行性升高趋势(见图1)。与NC组相比，DM组、DN-A组、B组、C组血清中TGF-β1表达水平较高(P<0.05)；与DM组相比，DN-A组、B组、C组TGF-β1表达升高(P<0.05)；随病情进展，TGF-β1也呈逐渐升高趋势(见图2)。Spearman分析结果提示，A、B、C组DN患者血清TGF-β1表达水平与Chemerin呈正相关(r=0.784，P<0.01)(见图3)。见表1。

 

注：“a”示与NC组相比，DM组血清中Chemerin表达升高，P<0.05；“b”示与DM组相比，DN-A组Chemerin表达升高，P<0.05；“c”示与DN-A组相比，DN-B组Chemerin表达升高，P<0.05；“d”示与DN-B相比，DN-C组Chemerin表达升高，P<0.05。

图1 各组血清中Chemerin蛋白的表达水平

 

注：“a”示与NC组相比，DM组血清中TGF-β1表达升高，P<0.05；“b”示与DM组相比，DN-A组TGF-β1表达升高，P<0.05；“c”示与DN-A组相比，DN-B组TGF-β1表达升高，P<0.05；“d”示与DN-B相比，DN-C组TGF-β1表达升高，P<0.05。

图2 各组血清中TGF-β1的表达水平

 

图3 DN患者中血清中 Chemerin 的浓度与TGF-β1蛋白的相关性分析

EndMT是参与早期DN发生发展的重要病理生理机制之一。研究表明，与DN肾脏纤维化密切相关的成纤维细胞有30%～50%来源于转分化的内皮细胞，表现为内皮细胞中成纤维细胞标记蛋白α-SMA的表达增加，内皮细胞标记蛋白CD31的表达量减少[4]，因此EndMT是DN肾脏纤维化发生发展的关键步骤。研究发现，在DN中高表达的TGF-β1是EndMT的关键调节因子[5]。Chemerin是近年来在肥胖及代谢综合征患者中发现的一种脂肪因子，与其配体ChemR23组成Chemerin/ChemR23信号轴，具有调节炎症及白细胞趋化的作用[6]。Adrych K等[7]研究发现慢性胰腺炎患者血清中Chemerin水平高于正常人，且与TGF-β1水平呈正相关，并据此推测慢性胰腺炎时，异常升高的Chemerin可通过趋化巨噬细胞浸润胰腺，导致TGF-β1产生和释放增多，进而引起胰腺纤维化。另一项在慢性丙型肝炎患者中的研究[8]发现，Chemerin在肝脏纤维化中发挥重要作用。这些研究均提示Chemerin/ChemR23参与了多种器官纤维化过程。

 

表1 各组血清中Chemerin及TGF-β1的表达水平

  

指标NC组DM组DN-A组DN-B组DN-C组Chemerin/(ng/ml)0.17±0.040.23±0.04a0.27±0.03ab0.34±0.05abc0.43±0.08abcdTGF-β1/(pg/ml)37.52±12.35224.46±34.88a320.41±127.94ab625.23±115.30abc830.82±153.28abcd

注：与NC组比较，aP<0.05；与DM组比较，bP<0.05；与DN-A组比较，cP<0.05；与DN-B组比较，dP<0.05。

  

图4 NC组及DN组肾组织Chemerin/ChemR23、α-SMA及CD31的免疫组化检测结果(400×)

3 讨论

2.2 NC组及DN组患者肾组织Chemerin/ChemR23、α-SMA及CD31的表达 NC组可见肾小球及肾间质血管中少量表达CD31及α-SMA，Chemerin及ChemR23主要表达于肾小球、肾小管上皮细胞和肾间质。与NC组相比，DN组肾小球中Chemerin/ChemR23及间质细胞表面标志物α-SMA表达增加，而内皮细胞表面标志物CD31的表达明显减少(见图4)。

在前期糖尿病大鼠模型实验中，已证实随DN病程进展，Chemerin/ChemR23及成纤维细胞标志物α-SMA表达逐渐增多，内皮细胞标志物CD31表达逐渐减少。DN末期可见肾间质微管内皮细胞共表达CD31和α-SMA，且随疾病进展，共表达面积增加，说明肾间质的微血管内皮细胞发生了转分化。且研究表明Chemerin/ChemR23在DN肾脏纤维化中发挥重要作用[9]。国内外关于Chemerin/ChemR23的研究报道很多，但主要是动物及细胞水平，本研究利用DN患者的血清及肾脏组织标本，从人体中再次验证了EndMT相关因子的变化与Chemerin/ChemR23的变化相一致，从而提示Chemerin/ChemR23系统与糖尿病肾病纤维化过程的内皮-间充质转分化相关。我们发现，与NC组相比，DM组患者血清中Chemerin/ChemR23及TGF-β1蛋白仅有少量表达，而DN患者中则明显表达，且Chemerin/ChemR23表达量与TGF-β1呈正相关。随疾病病程进展，其表达水平均逐渐升高。免疫组化中观察到，肾小球中Chemerin/ChemR23含量随病情的加重而增加，间质细胞表面标志物α-SMA表达增多，内皮细胞表面标志物CD31的表达则减少。该结果与国内外及前期动物实验结果一致。研究表明，体外培养的人皮肤微血管内皮细胞实验中，TGF-β1可通过诱导MAPT/ERK、PI3K及p38 MAPK磷酸化导致EndMT的发生，而加入相关抑制剂可以阻止EndMT的发生[10]，据此推测，DN中Chemerin/ChemR23系统可能通过MAPK途径导致EndMT的发生，但这些均需要进一步实验验证。

本研究存在部分不足：样本量较小，且缺乏分子水平的进一步验证，对于Chemerin/ChemR23参与DN肾脏纤维化的具体分子通路没有进行验证与说明，这些不足可能会影响实验结果的准确性与可信度。综上，DN患者Chemerin/ChemR23表达水平随病情进展而逐渐升高，并通过EndMT参与了肾脏纤维化的过程，血清Chemerin/ChemR23水平的异常升高可能与DN的发生发展有关，因此，检测患者血清中Chemerin/ChemR23水平对于临床早期诊断DN并评估病情有重要意义，同时该发现对研发延缓DN肾脏纤维化进展的靶向药物有指导意义。

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参考文献

[1] Srivastava S P,Koya D,Kanasaki K.MicroRNAs in kidney fibrosis and diabetic nephropathy: Roles on EMT and EndMT[J].Biomed Res Int,2013,2013:1-10.

[2] Wang Z,Han Z,Tao J,et al.Role of endothelial-to-mesenchymal transition induced by TGF-β1 in transplant kidney interstitial fibrosis[J].J Cell Mol Med,2017,21(10):2359-2369.

[3] Hu W,Yu Q,Zhang J,et al.Rosiglitazone ameliorates diabetic nephropathy by reducing the expression of Chemerin and ChemR23 in the kidney of streptozotocin-induced diabetic rats[J].Inflammation,2012,35(4):1287-1293.

[4] Zeisberg E M,Potenta S E,Sugimoto H,et al.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(12):2282-2287.

[5] Chang A S,Hathaway C K,Smithies O,et al.Transforming growth factor β1 and diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2015,310(8):F689-F696.

[6] Zylla S,Pietzner M,Kühn J P,et al.Serum chemerin is associated with inflammatory and metabolic parameters-results of a population-based study[J].Obesity,2017,25(2):468-475.

[7] Adrych K,Stojek M,Smoczynski M,et al.Increased serum chemerin concentration in patients with chronic pancreatitis[J].Dig Liver Dis,2012,44(5):393-397.

[8] Kukla M,Adamek B,Waluga M,et al.Hepatic chemerin and chemokine-like receptor 1 expression in patients with chronic hepatitis C[J].Biomed Res Int,2014,2014:1-12.

[9] 吴秋杰.Chemerin/ChemR23与糖尿病肾病内皮细胞-间充质细胞转分化的关系研究[D].郑州:郑州大学,2015.

[10] Medici D,Potenta S,Kalluri R.Transforming Growth Factor-β2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signaling[J].Biochem J,2011,437(3):515-520.