近年来，CRISPR/Cas9技术应用于细胞、动物和植物等方面的研究，对生命科学的研究有重要意义，它相比于传统的基因编辑——锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，更加精准和高效[1]。

近期，受多方面因素综合叠加影响，我国汽车产销增速下降。但从总体上看，目前我国汽车保有量2.35亿辆，居世界第二位；我国汽车年产销规模已近3000万辆，比美国多出近1倍，也远高于欧盟，居世界首位。如果仅靠临时性的政策刺激，恐难在如此高基数上持续增长。

QKI(quaking, QKI)是一类RNA结合蛋白质，可通过选择性剪切可转录产生QKI5、QKI6和QKI7 3种转录本，都具有同源的KH结构域[2]。目前，QKI的研究主要集中在神经、 心血管系统等研究领域[3- 5]。在生殖领域，QKI突变的雄性小鼠不育，其睾丸组织切片中几乎没有精子的存在，附睾组织中仅有精子头部和尾部畸形的无运动能力的精子[6]，表明QKI在精子发生中也有重要作用。

目前关于QKI在精子发生中的功能与机制的研究较少，本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了GC1-spg细胞系的QKI基因中与RNA结合的KH结构(K Homology domain, KH)的敲除细胞株，并从细胞增殖、分化等方面初步探索QKI在精子发生中的可能功能，为深入揭示QKI蛋白在精子发生中的功能和机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠精原细胞系GCI-spg(本课题组保存)；真核表达质粒px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(本实验室保存)；转染所用试剂Lipofectamine(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco-BRL公司)；DMEM培养基(Hyclone公司)；gRNA序列(擎科生物科技有限公司合成)；anti-QKI抗体(Millipore公司)；anti-Tubulin抗体和嘌呤霉素(Sigma-Aldrich公司)；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠；兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Cell Counting Kit- 8(同仁化学研究所)；Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit(Roche公司)；TransStart Tip Green qPCR Super Mix(Transgen Biotech公司)。

1.2 方法

由上述实验结果得出QKI可以影响细胞增殖；在检测c-kit、Stra8和Lhx8这些减数分裂早期关键分子[7- 8]与 Hspa2、Zfp42和Mtl5 等减数分裂后期的关键分子[9- 10]时，c- kit、Mtl5和Hspa2的表达量变化都提示了QKI蛋白在精子发生过程中具有重要作用；这些将为深入揭示QKI蛋白在精子发生中的功能奠定了良好基础。

1.2.2 质粒和重组体的构建：将合成的两条oligo DNAs按照上游下游各100 pmol的比例进行100 ℃反应10 min，后自然降温退火至室温，形成双链DNA，与PX330质粒用T4连接酶连接，进而转化DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆，进行测序确认后，提取质粒备用。

两组患者均采取相应的手术方式进行治疗，观察组和对照组分别配合给予手术室围手术期护理和常规护理，观察组的护理措施如下。

马克·吐温是著名的批判现实主义作家，他的笔下描绘了很多形形色色的社会人物形象，写实与幽默的同时又常暗含嘲讽之意。目前对马克·吐温短篇小说的研究，基本可以概括为以下两个方面：

1.2.5 CCK8测量增殖曲线：在96孔板中种植一定数量(1 000个)细胞，12 h后待细胞完全贴壁后，加入10% CCK8检测液和90% DMEM完全培养基的混合液。将细胞置于培养箱孵育75 min后，检测450和630 nm处吸光度值，检测细胞增殖情况。

2.1.2 Western blot与测序验证敲除细胞株：获得1#靶点单细胞株3株，2#靶点单细胞株3株，Western blot检测结果(图2A)，其中1#06测序结果(图2B)得到GTCCGAG碱基缺失突变体，测序峰图结果(图2C)表明突变细胞株是在该区域因碱基缺失造成移码突变。后续功能检测实验均选择1#06进行实验。

1.2.3 细胞转染及单克隆的筛选：根据GC1-spg细胞的特征，选择Lipofectamine做转染试剂，按照其说明书提供的方法进行转染细胞，待质粒表达36 h后，用加入3 mg/L嘌呤霉素，待阴性对照中细胞完全死亡，停止加药，待细胞长到适当数量，进行单克隆分选，挑选有效单克隆细胞，扩大培养至可用来DNA测序和Western blot验证。

1.3 统计学分析

利用GraphPad Prism 5.01 进行统计和作图，各图表中的数据均以平均数±标准差来表示，实验组与对照组间采用t检验。

（2）评估单元的开发背景分析。对开发历程的了解与把握，采油厂具有相当大的优势。一个评估单元往往具有较长的开发历程，对这个历程各阶段及其变化的了解程度有助于SEC储量评估的准确性。如某评估单元就是一个典型例子（见图3），单元整个开发历程划分为五个阶段，每个阶段及其转换期的评估参数选取存在较大差异。

2 结果

2.1 构建GC1-spg的QKI敲除细胞株

2.1.1 靶点设计示意图：QKI基因敲除靶点位置(图1)，敲除靶点序列长度为20 bp，1#靶点和2#靶点分别位于KH的+67到+86处和+13到+32处(1#靶点序列为：5′-GGATGTAAAATAATGGTCCG-3′，2#靶点序列为：5′-GGGAGAATCCTTGGACCTAG-3′)

肌理技法不仅是工笔花鸟画中的一种技法，也是作者的思想感情和个性的表达。就像色彩和线条等的表现一样，都可以表达艺术家内心的情感和自己独特的思维，不同形式的肌理效果表达了作者不同的思想感情。肌理的产生使画面效果变得更加有深度感，引发人们不断地去思考，去创新。它也使画面变得更加的生动、活泼，带给人们一种新的空灵感。

1.2.6 q-PCR对mRNA水平的检测：利用 Trizol法提取细胞中的总RNA，后用Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit进行反转录，再进行荧光定量PCR检测c-kit、Stra8、Lhx8、Hspa2、Zfp42和Mtl5的相对表达量。

金融机构与健康旅游的合作机制正在建立。2014年，国家提倡将政府和社会资本合作(PPP)模式用于医疗、旅游等领域。2015年，百度联合安联保险发起设立百安保险，开展旅行险、健康险等业务。2016年，阿里巴巴在健康险领域的主要平台——阿里健康成立，主营互联网健康险业务。当然，商业健康保险等金融服务发挥的作用还不够，企业融资机制也不完善，由数据分析机构易观发布的《海外医疗市场专题分析(2017)》显示，主营业务为海外医疗服务的47家中介和互联网平台企业中，仅有4.3%的企业融资轮数超过A轮[8]。

2.2 QKI对GC1-spg细胞增殖与分化的影响

2.2.1 QKI蛋白对于细胞增殖的影响：测定QKI敲除成功的细胞株增殖曲线结果(图3)，实验组Cas-QKI细胞增殖明显慢于对照组(P<0.05)。

  

图1 QKI基因敲除靶点Fig 1 Diagram of QKI gene target site

 

A.cells were collected for Western blot; B,C.cells were collected for PCR, and B.sequence PCR product compared with wild type, C.sequencing peak map, the red line marked the mutation

图2 敲除细胞株的鉴定Fig 2 Identification of the knock-out cell strain

  

*P<0.05 compared with control group图3 CCK8检测QKI对细胞增殖的影响Fig 3 CCK8 method was used to detect the proliferation of QKI-knocking out cells

2.2.2 QKI蛋白对于细胞分化的影响：检测减数分裂相关分子标志基因的表达水平，发现实验组c-kit、Mtl5的表达量相较于对照组有显著降低(P<0.01)，Hspa2表达量也低于对照组(P<0.05)(图4)。

比如，在教学三角形中位定理的课堂教学中，教师可为此引入具体的实例和问题，即∶在对某个池塘的宽度 AB进行测量时，有人在池塘外任意取一点C，并连结AC、BC，之后，分别取AC、BC的中点D、E，并将其连接起来。而将DE的长度量出后，则就得到AB的长度，也就是该池塘的实际宽度。对于这种问题的提出，极大的调动学生对问题的探究欲望。在此过程中，教师还要引导学生对该案例进行深入探讨，适当的引入几何原型，以此能够更好的探索三角形的中位现定理，提高学生学习效果。

  

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group图4 QKI蛋白对细胞进入减数分裂的影响Fig 4 Effect of QKI protein on cells’ meiosis

3 讨论

在体外机制的研究中，常用RNA干扰(RNA interference, RNAi)进行基因沉默，影响蛋白质表达，但是由于siRNA的持续作用时间较短，一般传代2～3代就会失效，而且受细胞的转染效率和状态影响大，靶点的敲低效率也不稳定，同时对于一些周期比较长的实验不适用，所以本研究选择利用CRISPR/Cas9构建稳定细胞株，可以解决RNAi的技术弊端。

[2] Teplova M, Hafner M, Teplov D, et al. Structure-function studies of STAR family Quaking proteins bound to their in vivo RNA target sites[J]. Genes Dev, 2013, 27: 928- 940.

目前QKI在精子发生中的功能与机制的研究较少，本研究利用上述构建的QKI敲除细胞模型，初步观察了该基因对生精细胞的增殖和分化的影响。

首先，假设UAV从S点出发，到达目的地F点完成盘点任务。飞行空间中(车间内)存在很多设备和管道之类的危险区域，在UAV飞行过程中需要避开危险区域。将整个空间飞行路径划分成m个相等的子空间，且有n个飞行候选节点。

1.2.1 敲除靶点的设计及QKI的测序引物设计：利用麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/设计QKIDNA区域的一对oligoDNAs，根据得分高低选择合适的一对引导RNA序列。同时，在QKI敲除区域的上下游选择合适的位置设计测序引物，用于后续的PCR鉴定和测序检测。

但是精子发生是一个特殊的分化过程，涉及生物学过程很多，而目前生精细胞在体外的培养和继续减数分裂难度大，本研究中选择的GC1-spg也仅是永生化的精原细胞株，不能全面代表精子发生的整个过程，所以要真正阐释QKI蛋白在精子发生中的功能表型与详细机制，还需进一步结合体内的功能研究。

1.2.4 Western blot检测蛋白的表达：将构建成功的PX330重组表达质粒转化GC1-spg细胞，培养48 h后，收取细胞，用1×SDS裂解液(50 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 6.8, 125 μL 80%甘油, 10% SDS, 625 μL H2O)裂解细胞样品，致使细胞呈黏稠透明液体，100 ℃变性10 min，后用BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳，分离蛋白，用320 mA进行恒流转膜，后用相应的各抗体进行检测。

参考文献：

[1] Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32: 347- 355.

由于QKI有3个转录本，就其序列进行分析，其3个转录本高度同源，仅在3′端氨基酸序列与个数不同，其QUA结构域具有介导信号传导的作用；KH可以与RNA结合，通过与RNA结合参与生物学过程。本研究利用CRISPR/Cas9技术对GC1-spg细胞的QKI进行KH结构域定点敲除，共筛出6株单细胞(1#靶点3株，2# 靶点3株)。CRISPR/Cas9技术虽然持续周期较长(2个月左右)，但是其敲除效率高，构建出的细胞株可以稳定缺失QKI，构建成功的细胞株不会因为传代次数增多而恢复，所以可以为体外功能与机制研究提供合适的细胞模型。

[3] Busse TM, Roth JJ, Wilmoth D, et al. Copy number alterations determined by single nucleotide polymorphism array testing in the clinical laboratory are indicative of gene fusions in pediatric cancer patients[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2017, 56: 730- 749.

[4] Hayakawa-Yano Y, Suyama S, Nogami M, et al. An RNA-binding protein, Qki5, regulates embryonic neural stem cells through pre-mRNA processing in cell adhesion signaling[J]. Genes Dev, 2017, 31: 1910- 1925.

[5] Ramkissoon SH, Bandopadhayay P, Hwang J, et al. Clinical targeted exome-based sequencing in combination with genome-wide copy number profiling: precision medicine analysis of 203 pediatric brain tumors[J]. Neuro Oncol, 2017, 19: 986- 996.

[6] Yanagimachi R, Wakayama T, Kishikawa H, et al. Production of fertile offspring from genetically infertile male mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101: 1691- 1695.

[7] Feng CW, Bowles J, Koopman P. Control of mammalian germ cell entry into meiosis[J]. Mol Cell Endocrinol, 2014, 382: 488- 497.

[8] Mithraprabhu S, Loveland KL. Control of KIT signalling in male germ cells: what can we learn from other systems?[J]. Reproduction, 2009, 138: 743- 757.

[9] Govin J, Caron C, Escoffier E, et al. Post-meiotic shifts in HSPA2/HSP70.2 chaperone activity during mouse spermatogenesis[J]. J Biol Chem, 2006, 281: 37888- 37892.

[10] Sugihara T, Wadhwa R, Kaul SC, et al. A novel testis-specific metallothionein-like protein, tesmin, is an early marker of male germ cell differentiation[J]. Genomics, 1999, 57: 130- 136.