肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一种肺小动脉原发性病变，是当肺动脉压力超过一定界值(25 mmHg, 海平面静息状态) 的血流动力和病理生理状态。PAH的主要特征是肺血管过度收缩、异常血管重构和肺小动脉阻塞[1]。血管重构主要由内皮细胞(endothelial cells, ECs)功能紊乱和α-SMA阳性细胞大量增多引起[2]。内皮-间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)导致肺血管中α-SMA阳性细胞积累，参与了血管重构的发生[3]。

到目前为止骨成形蛋白Ⅱ型受体(BMPRⅡ)突变是PAH患者中最常见的突变类型。重编程技术的出现得以使相关研究不再局限在疾病终末期细胞类型，通过将患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)定向分化为ECs，为研究PAH血管重构提供发育模型[4- 5]。本研究选取正常人和遗传性PAH(heritable PAH, HPAH)患者来源的肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells，hPASMCs)，重编程为iPSCs，再将其定向分化为ECs，建立HPAH体外疾病模型。比较对照(CON)和HPAH来源iPSC-ECs的转分化相关基因表达和成管功能差异，旨在探讨HPAH血管重构的可能发生机制，为针对肺血管重构进行靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：Essential8TM培养基、胰蛋白酶、无酚红IMDM培养基、DMEM/F12培养基和免疫荧光二抗(Thermo Fisher公司)；基质胶(BD公司)；VEGF165、Trizol总RNA提取试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；小鼠抗人CD31抗体和小鼠抗人α-SMA抗体(Dako公司)；兔抗人VE-cadherin抗体(CST公司)；兔抗人CD146抗体(Abcam公司)；CD31免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司)；仙台病毒重编程试剂盒(Invitrogen公司)。

1.1.2 标本来源：PAH患者和CON志愿者hPASMCs由英国剑桥大学Nicholas W Morrell实验室馈赠，PAH 患者通过基因测序鉴定了BMPRII C347R突变，CON hPASMCs取自肺癌患者肺移植远离肿瘤部位的肺组织。

1.2 方法

1.2.1 诱导产生和培养多能干细胞：将仙台病毒转染导入hPASMCs后接种于6孔板，按说明书两周左右形成iPSCs克隆，对其进行标准鉴定。iPSCs培养于Essential 8TM培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天换液，5 d传代。

1.2.2 内皮细胞的分化：配制中胚层分化养基和血管分化培养基。细胞培养至汇合度为80%，按1∶40比例传代，每天换液，培养3 d后，即分化第0天，将Essential 8TM培养基换成中胚层分化培养基，37 ℃培养3 d；分化第3天，将中胚层分化培养基换成血管分化培养基，37 ℃培养2 d；分化第5天，更换新鲜血管分化培养基。

1.2.3 内皮细胞的培养：分化第7天，用CD31免疫磁珠富集内皮细胞，接种于明胶包被的培养皿中，Endothelial cell-SFM培养基培养，隔天换液，4 d传代1次，细胞可传代培养5代。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测mRNA：收集分化第0、1.5、3、5和7天样品，Trizol法提取总RNA，检测其浓度，将2 μg总RNA反转录合成cDNA，以GAPDH基因为内参基因，扩增NANOG、OCT4、Brachyury、KDR、CD31和α-SMA等基因，查询文献，设计合成引物(表1)。

近年来对于EndoMT的发生机制已有不少研究报道，野百合碱诱导的大鼠PAH模型中血管内钙黏蛋白(VE-cadherin)表达显著下调，转录抑制因子Snail和Slug增加[6]。PAH中EndoMT过程由HMGA1和下游的Slug调控[7]。那么HPAH来源iPSC-ECs是否存在同样的现象呢？本研究中HPAH来源iPSC-ECs的α-SMA、HMGA1、Slug和Snail1等基因的mRNA水平高于CON，提示HMGA1、Slug和Snail1可能参与了调控iPSC-ECs的EndoMT过程。同时与CON相比HPAH来源的iPSC-ECs的成管存在缺陷，VEGF165可恢复其成管功能。在ECs分化过程中，HPAH中VEGFR2表达始终低于CON，猜测HPAH来源iPSC-ECs的成管缺陷可能是VEGF信号下调导致的。接着检测了iPSC-ECs中VEGFR2的mRNA和细胞中的蛋白水平，结果HPAH来源iPSC-ECs中VEGFR2的表达低于对照。综上，本研究表明HPAH来源的iPSC-ECs存在EndoMT现象和成管功能缺陷，HMGA1、Snail家族转录因子和VEGF通路可能参与对HPAH血管重构的调控。

1.2.5 间接免疫荧光染色检测内皮表面标志分子：细胞培养在细胞爬片上，增殖至合适汇合度，弃去培养基，PBS洗两遍。每孔加入100 μL 4%的多聚甲醛固定，4 ℃放置30 min。弃去固定液， 每孔加300 μL PBS，室温放置5 min， 弃洗涤液，重复3次。弃去清洗液后，加入300 μL含0.3% Triton X-100的PBS，室温放置3 min。用PBS清洗3遍，每次5 min，用含5%驴血清的PBS室温封闭1 h。封闭后加入一抗，4 ℃过夜。弃去一抗，PBS清洗3遍，每次5 min，再加入二抗室温避光孵育1 h。弃去二抗，用PBS清洗3遍，每次5 min，最后加入DAPI，室温避光放置5 min，PBS清洗3遍后荧光显微镜下观察拍照。

根据笔者了解，H社区的主要消防技术、消防知识来源于区消防大队的定期培训和社会上一些消防器材公司进社区的宣讲。 但是这些培训和宣讲间隔周期较长，知识内容不够全面，技术水平无法及时提高，且社区内的消防专业人才匮乏，安监站的成员并非消防员出身，对消防安全服务供给的重视程度低。

 

表1 qPCR引物序列Table 1 Sequences of primers for qPCR

  

geneforwardprimer(5'-3')reverseprimer(5'-3') GAPDHAACAGCCTCAAGATCATCAGCGGATGATGTTCTGGAGAGCCNANOGCATGAGTGTGGATCCAGCTTGCCTGAATAAGCAGATCCATGGOCT4TGGGCTCGAGAAGGATGTGGCATAGTCGCTGCTTGATCGBrachyury(T)TGCTTCCCTGAGACCCAGTTGATCACTTCTTTCCTTTGCAT-CAAGCD31GCATCGTGGTCAACATAA-CAGAAGATGGAGCAGGACAGGTTCAGVEGFR2TTTTTGCCCTTGTTCTGTCCTCATTGTTCCCAGCATTTCAα-SMAACTGAGCGTGGCTATTCCTC-CGTTGCAGTGGCCATCTCATTTTCAHMGA1AGGAAAAGGACGGCACT-GAGAACCCCGAGGTCTCTTAGGTGTT-GGSlugCATGCCTGTCATACCACAACGGTG-TCAGATGGAGGAGGGSnail1GAGGCGGTGGCAGACTAGGACACATCGGTCAGACCAG

1.2.6 成管实验：预先用基质胶包被96孔板，放入37 ℃培养箱，15 min后消化细胞，细胞计数，96孔板每孔接种10 000个细胞，分为对照组和VEGF165处理组，对照组加入无血清培养基，VEGF165处理组加入含有30 μg/L VEGF165的无血清培养基，37 ℃培养4 h后显微镜下观察拍照，用Image J软件分析统计成管数目、结点数目及成管长度。实验重复3次。

1.3 统计学分析

HPAH来源iPSC-ECs中，基因HMGA1、Slug和Snali1表达高于CON(图4)。

2 结果

2.1 iPSCs向ECs分化的细胞形态变化

分化1 d细胞逐渐向周围分散，细胞之间间隙增大，周边可见形状不规则的单个细胞，分化3 d时，细胞进一步分散，分化至第7天，可观察到ECs典型形态铺路石状的细胞产生(图1)。

  

图1 iPSCs向ECs分化不同时间点的细胞形态Fig 1 Images of iPSCs differentiated into ECs at different time points (scale bar=100 μm)

2.2 HPAH和CON来源 iPSCs分化不同时间点基因表达

分化过程中iPSCs标记基因NANOG和OCT4表达逐渐降低；中胚层标记基因Brachyury(T)表达先升高后降低，分化1.5 d达到峰值；VEGFR2表达逐渐升高且HPAH组高于CON组；内皮细胞标记基因CD31表达升高，HPAH组分化5 d达到峰值；分化5 d时平滑肌标记基因α-SMA出现，HPAH组表达先升高后降低，CON组表达逐渐升高(图2)。

2.3 ECs形态及表面分子标志鉴定

——坚定践行绿水青山就是金山银山理念，建立了最严格的自然资源保护制度，严守生态保护红线、耕地利用底线、资源利用上线，加快生态保护修复，为推进生态文明建设奠定了坚实基础。

内皮细胞表面分子标志CD31、CD146、VE-cadherin及vWF均为阳性，CON组无α-SMA表达，HPAH组iPSC-ECs有少量α-SMA表达(图3)。

  

图2 分化过程中不同时间点相关基因mRNA表达水平Fig 2 Relative mRNA expression profiling of relative genes at different time points during differentiation

  

A.images of CON and HPAH iPSC-ECs; B.immunofluorescence staining of iPSC-ECs图3 CON和HPAH来源iPSC-ECs表面标志鉴定Fig 3 Identification of endothelial cell markers in CON and HPAH-derived iPSC-ECs(scale bare=100 μm)

2.4 EndoMT相关调控基因检测

实验数据以平均值±标准差形式表示, 显著性差异分析采用GraphPad Prism 5软件进行。

2.5 HPAH和CON来源ECs成管功能比较

1）设计运营架构，即从政府、企业以及行业三方着手，调查其涉及的相关业务，在构建运营架构之后协调三方的关系，在确保其具有良好的交互关系后，便可以按照相互协作、管理和投资等关系进行城市运营活动；

Craig和Graham并非同时自由拍摄，而是商量好了各自轮流拍摄半小时。对于拍摄全情投入格斗中的模特，Craig坦言他感觉不是很熟悉，“对我来说，拍摄动作场景是最大的挑战。因为我平时主要拍的都是静态的肖像或是风光摄影。”

2.6 HPAH来源iPSC-ECs 中VEGFR2表达下调

HPAH来源iPSC-ECs中VEGER2的mRNA水平低于CON(P<0.01)(图6A)。HPAH和CON组iPSC-ECs表面均有VEGFR2表达，但HPAH来源iPSC-ECs低于CON(图6B)。

HPAH和CON来源iPSC-ECs均能形成管腔结构，通过统计学分析，HPAH组成管数目、结点数目及成管长度均低于CON组(P<0.01)。VEGF165处理后HPAH组成管数目、结点数目及成管长度增加(P<0.05)(图5)。

3 讨论

层次分析法是国际关系研究的重要方法，肯尼迪·沃尔兹认为战争的爆发与决策者个人、国家和国际系统三个层次的因素相关［10］。进入 21世纪以来，随着中美实力差距的缩小，有关中美两国是否会陷入“修昔底德陷阱”的讨论日益增多。因此，笔者拟从体系层次、国家层次和个体层次三个层次对这一问题进行分析。

（5）建立中国-约旦产业合作园区。国际合作机制对于区域的长久有效合作至关重要在信息化、全球化日益蔓延的今天，需要创新合作区域合作方式，将以单个项目、单个领域里的合作转变为双方利益融合、拓宽合作领域的交融式合作。可以应用创新的合作模式为中约经贸合作开辟新道路，建立境外经贸合作园区既可以实现地缘邻近但政治基础差异化的区域实现资源互补、产业转移，同时还可以提升区域整体竞争力。考虑到约旦的综合国力，可开拓灵活且多元化的合作机制，形成跨国区域开放新模式。例如，建立中国-约旦产业合作园区，鼓励中国企业去约旦投资。

  

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with CON图4 CON和HPAH来源iPSC-ECs中基因α-SMA、HMGA1、Slug和Snail1表达Fig 4 Relative mRNA expression of α-SMA, HMGA1, Slug and Snail1 in CON and HPAH-derived iPSC-ECs

 

A.unstimulated CON-derived iPSC-ECs(×40); B.stimulated CON-derived iPSC-ECs with VEGF165(×40); C.unstimulated HPAH-derived iPSC-ECs(×40); D.stimulated HPAH-derived iPSC-ECs with VEGF165(×40); E,F,G.analysis of tube number, junction number and total branching lengths; *P<0.01 compared with control; #P<0.05 compared with unstimulated of VEGF165

图5 HPAH和CON来源 iPSC-ECs成管功能比较Fig 5 Comparison of tube formation function in CON and HPAH-derived n=3)

  

A.VEGER2 mRNA expression, *P<0.01 compared with CON; B.immunofluorescence staining of VEGFR2(scale bar=100 μm)

 

图6 CON和HPAH来源iPSC-ECs中VEGER2 mRNA表达水平和细胞免疫荧光染色

 

Fig 6 VEGER2 mRNA expression and immunofluorescence staining in CON and HPAH-derived

由于遗传因素和环境因素的影响，不同个体的ECs功能紊乱在HPAH中的发生机制可能有所差异，这可能成为逆转PAH发展进程的障碍[8]。实验结果表明HPAH患者来源iPSC-ECs表型和功能存在缺陷。通过进一步对不同患者来源iPSC-ECs进行表达谱分析，可能发现新的表达差异基因，从而为揭示PAH发病机制提供线索。并且将患者特异性iPSC-ECs作为研究对象，可为患者个体化治疗方案的制定提供理论依据。

参考文献：

[1] Tuder RM, Marecki JC, Richter A, et al. Pathology of pulmonary hypertension[J]. Cardiol Clin, 2004, 22:223- 247.

[2] Ranchoux B, Antigny F, Ruckermartin C, et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension[J]. Circulation, 2015, 185:1850- 1858.

[3] Good RB, Gilbane AJ, Trinder SL, et al. Endothelial to mesenchymal transition contributes to endothelial dysfunc-tion in pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Pathol, 2015, 185:1850- 1858.

[4] Orlova VV, van den Hil FE, Petrusreurer S, et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells[J]. Nature Protocols, 2014, 9:1514- 1531.

本文研究了新时期三峡旅游较为完整的发展状况和发展格局，弥补了近年三峡地区旅游研究的空白。由于景区节点及圈定三峡研究范围的确定以采集到的信息的关键词分析和实际考察认定的主要景区为主，所以可能会对三峡部分景区有遗漏，在一定程度上影响本研究的结果。如何选择研究节点及研究范围的确定还值得进一步商榷。此外，对游客行为中的出行方式、旅游天数、属性特征、景区评价等相关信息也值得深入研究。

[5] Belair DG, Whisler JA, Valdez J, et al.Human vascular tissue models formed from human induced pluripotent stem cell derived endothelial cells[J]. Stem Cell Rev, 2015, 11:511- 525.

[6] Nikitopoulou I, Orfanos SE, Kotanidou A, et al. Vascular endothelial-cadherin downregulation as a feature of endothelial transdifferentiation in monocrotaline-induced pulmonary hypertension[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2016, 311:L352-L363.

[7] Hopper RK, Moonen JA, Diebold I, et al. In pulmonary arterial hypertension, reduced BMPR2 promotes endothelial-to-mesenchymal transition via HMGA1 and its target slug[J]. Circulation, 2016, 133:1783- 1794.

新时期，企业发展过程中需要面对更加激烈的市场竞争环境，在这种情况下，采取有效措施不断提升企业的综合竞争力以及员工工作绩效具有重要意义，在这一过程中要求企业对充分挖掘心理资本的潜在激励效应重要性产生深刻认知[6]。在实际进行工作分析的过程中，应对不同职位员工的心理资本需求进行深入分析，并集中思考员工的心理资本需求；在实际展开人才选拔以及招聘工作的过程中，应对心理资本进行集中测试与考察，为突出企业在市场经济中的竞争优势提供保障；同时还应高度重视日常培训工作，综合应用多种培训模式，为企业员工在长期工作中形成积极的心理状态提供保障。

[8] Rabinovitch M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension[J]. J Clin Invest, 2008, 118:2372- 2379.