疟疾是由蚊媒传播疟原虫感染而引起的寄生虫病，目前仍然是威胁人类健康的3大传染病之一。2016年大约2.16亿人感染疟疾，共有44.5万人死于疟疾，99%死亡患者是受到恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染，其中5岁以下儿童的病死率占到70%(WHO World Malaria Report 2017)。研发出安全有效的疟疾疫苗成为该公共健康领域的一项重要目标，然而目前还没有预防效果令人满意的疟疾疫苗上市。DNA疫苗是一种新型疫苗，可以激发机体产生体液免疫和细胞免疫，相比传统的蛋白质疫苗有诸多的优点，广泛用于病原体感染、肿瘤及自身免疫病等疾病研究。在疟疾疫苗研究方面，DNA疫苗也逐渐受到重视，两项针对恶性疟原虫子孢子/肝期的DNA疫苗已进入到临床研究阶段，显示了DNA疫苗在疟疾研究领域良好的应用前景[1- 2]。

恶性疟感染在红内期发育阶段导致临床症状的发生，严重者可致死亡。针对恶性疟红内期感染的疫苗可以抑制寄生虫血症，减轻临床症状，降低疟疾病死率。本研究室前期研究基于恶性疟原虫红内期多表位人工随机重组蛋白疫苗编码序列设计的核酸疫苗VR1012-ES312，在小鼠实验中显示，其可以激发一定水平的特异性体液免疫和细胞免疫反应[3]。本研究将抗原与靶向树突状细胞(DCs)的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原- 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA- 4)胞外段融合表达，并在免疫时加入细胞因子佐剂，旨在探讨是否能够进一步加强疟疾DNA疫苗的免疫效力。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293细胞、DMEM高糖培养基、RPMI- 1640培养基、胎牛血清(FBS)和抗生素(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；DC2.4细胞(上海慧颖生物科技有限公司)；引物合成和测序(Invitrogen公司)；限制性内切酶(NEB公司)；抗ES312- IgY抗体(本研究室制备)；HRP标记的AntiChicken IgY(Promega公司)；HRP或FITC标记的山羊抗小鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司)。

近日，上海振华重工正式发布全新一代无人驾驶跨运车和智能集卡。据了解，该无人驾驶跨运车主要分为一过三和一过一两种型号。一过三跨运车自重69吨，额定载荷50吨、16米高、5米宽、10米长，配置双箱可分离吊具。大车速度每小时24公里，起升速度每分钟24米，内侧转弯半径仅为3.3米。一过一跨运车除了高度为10.5米，自重58吨，其他参数与一过三相同。振华重工最新推出的智能集卡解决方案，为港口自动化、智能化升级改造提供一种全新的、低成本、影响最小的水平运输自动化解决方案。该无人驾驶集卡系统解决方案采用了振华重工自主研发的车队管理系统，集成了车辆群控等核心算法模块。

1.2 方法

1.2.1 表达载体构建及质粒提取：人工合成两端带有Pst Ⅰ和Sal Ⅰ位点的分泌肽tPA leader编码序列连入VR1012质粒，进而与从质粒VR1012-ES312经Sal Ⅰ/Bgl Ⅱ酶切得到的ES312表达框连接，构建分泌型表达质粒VR1012-sES312。使用引物sC4- 1/sC4- 2，以小鼠cDNA文库为模板扩增CTLA- 4胞外区，克隆入VR1012-sES312质粒，得到融合抗原表达载体VR1012-sES312-CTLA。小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimu-lating factor,GM-CSF)序列通过引物CSF- 1/CSF- 2扩增，克隆入VR1012载体，构建表达质粒VR1012-GMCSF(图1,表1)。

数据统计处理与作图采用GraphPad Prism软件。数据结果以平均值±标准差表示，各实验组之间的比较采用t检验方法。

1.2.2 细胞转染及质粒表达的检测: 转染前24 h将HEK293细胞按1×105个/0.5 mL每孔接种于24孔板，转染过程参照VigoFect转染试剂盒(威格拉斯生物技术公司)说明书操作，转染后继续培养60 h。Western blot 检测转染细胞上清液蛋白表达水平。即取VR1012-sES312转染细胞培养上清，并以VR1012空载体转染的细胞蛋白抽提物以及VR1012-ES312转染细胞的上清液和细胞总蛋白抽提物为对照，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜，以Anti-M.RCAg- 1 IgY为一抗(1∶2 500稀释)，HRP标记的Anti-Chicken IgY为二抗(1∶20 000)孵育，化学发光法(ECL)显影。

[2] Richie TL, Charoenvit Y, Wang R, et al. Clinical trial in healthy malaria-naive adults to evaluate the safety, tolerability, immunogenicity and efficacy of MuStDO5, a five-gene, sporozoite/hepatic stage Plasmodium falciparum DNA vaccine combined with escalating dose human GM-CSF DNA [J]. Hum Vaccin Immunother, 2012, 8: 1564- 1584.

1.2.3 CTLA结合实验:参照文献[4]方法，分别收集VR1012、VR1012-sES312以及VR1012-sES312-CTLA转染HEK293细胞培养60 h上清液；DC2.4细胞使用2% FBS/PBS(胎牛血清/磷酸盐缓冲液)溶液洗涤2次，重悬于100 μL 2% FBS/PBS溶液中。加入100 μL HEK293细胞浓缩上清，室温孵育1 h后洗涤，加入100 μL抗ES312-IgY抗体(1∶1 000)，室温孵育1 h后洗涤。加二抗(Abcam Goat Anti-Chicken IgY H&L Alexa Fluor®488) (1∶500)，孵育30 min，洗涤后加入100 μL新鲜配制的2%甲醛/PBS固定5 min，流式细胞计量术(FACS)检测。

  

图1 疟疾DNA疫苗表达载体构建示意图Fig 1 Schematic representation of the constructed malaria DNA vaccines

 

表1 表达载体构建所用引物Table 1 Primers used in construction of expression vectors

  

primersequence(5'-3') sC4-1CCCggatccGCTAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGAGGAGAAGCCATACAGGTGACCCAACsC4-2GGAagatctTCAAGAATCCGGGCATGGTTCCSF-1ACGCgtcgacGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCCSF-2CGCggatccTCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGCATTC

Lowercase letters in the sequence are restriction enzyme sites; (GS)-linker sequence is shown in underline.

本研究改造了原有疟疾DNA疫苗设计，使得抗原表达后分泌到细胞外并靶向DC细胞。同时采用基因佐剂GM-CSF共同免疫的策略，大大促进了体液和细胞免疫水平，显著增强了DNA疫苗的免疫效力，为研制有效的疟疾DNA疫苗提供了新的思路。

1.2.5 特异性IgG抗体、细胞因子检测及间接免疫荧光实验(IFA)：最后1次免疫结束后第10天收集小鼠血清和脾细胞。ELISA法测定血清抗体效价、ELISPOT法检测细胞因子表达以及IFA检测抗血清识别疟原虫天然蛋白等操作均参照文献[3]方法进行。

[4] Gan L, Jia R, Zhou L, et al. Fusion of CTLA- 4 with HPV16 E7 and E6 enhanced the potency of therapeutic HPV DNA vaccine [J]. PLoS One, 2014, 9: e108892.doi:10.1371/journal.pone.0108892.

1.3 统计学分析

The thickness between the beam and inside reinforcing member of the original bumper is 1 mm. Simulating by setting the thickness as 1.5 mm and 2 mm respectively, and the comparison diagram of the bumper displacements with different thicknesses is shown in Figure 8.

2 结果

2.1 VR1012-sES312-CTLA质粒分泌表达

VR1012-sES312-CTLA质粒转染细胞培养上清出现约90 ku的特异条带，与ES312-CTLA融合蛋白理论分子质量大小相符；对照未融合CTLA的非分泌型VR1012-ES312质粒转染细胞，在细胞总蛋白抽提物检测到约65 ku大小的ES312蛋白条带[5]，而在细胞培养上清中未检测到ES312表达，表明VR1012-sES312-CTLA质粒可以在真核细胞中正确表达并分泌ES312-CTLA融合蛋白(图2)。

  

1.supernatant of VR1012-sES312-CTLA transfected cell culture; 2.extract from VR1012-ES312 transfected cell; 3.supernatant of VR1012-ES312 transfected cell culture; 4.extract from VR1012 transfected cell图2 免疫印记检测DNA疫苗载体转染HEK293细胞表达的蛋白Fig 2 Immunoblotting detection of protein expressed by HEK293 cells transfected with DNA vaccine vectors

2.2 CTLA融合蛋白与DC2.4细胞亲和性分析

与VR1012-sES312细胞培养上清相比，含有CTLA重组抗原蛋白的VR1012-sES312-CTLA细胞培养上清显著增强了DC2.4细胞平均荧光强度(MFI)的偏移，阳性细胞率由7.67%提高到31.64%(图3)。

  

图3 转染HEK293细胞培养上清的蛋白结合表达B7的DC细胞Fig 3 Protein in supernatant of transfected HEK293 cells binding to B7-expressing DC cells

2.3 免疫后各组IgG效价和细胞免疫应答检测

免疫小鼠血清IgG抗体ELISA结果(图4A)显示，VR1012-sES312免疫组、VR1012-sES312-CTLA免疫组以及VR1012-sES312+GM-CSF共免疫组较之原设计非分泌型VR1012-ES312免疫组的抗体滴度均显著提升，分别是VR1012-ES312免疫组的5倍、54.5倍和33倍(P<0.001)；VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF共免疫组相比单独VR1012-sES312-CTLA免疫组或者VR1012-sES312+GM-CSF共免疫组抗体滴度也有明显增加(P<0.01)；VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF共免疫组比VR1012-ES312免疫组抗体滴度提高190倍(P<0.001)。ELISPOT结果显示，与对照VR1012-sES312实验组比较，VR1012-sES312-CTLA组以及VR1012-sES312+GM-CSF基因佐剂共免疫组均能显著地促进脾细胞IFN-γ和IL- 4细胞因子的分泌(P<0.001) (图4B，C)。

2.4 免疫血清对疟原虫天然抗原的识别

优化设计改造后的DNA疫苗免疫血清仍然能够识别恶性疟原虫3D7株天然虫体抗原(图5)，其中VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF共免疫组识别天然抗原的IgG滴度高达1∶3 200，VR1012-sES312-CTLA免疫组识别滴度达1∶1 600，0.9%氯化钠溶液与空载体VR1012免疫组对照组不识别天然抗原。

3 讨论

参考文献：

改善DNA疫苗的免疫效力的一种手段是直接将抗原靶向APCs。CTLA- 4表达在活化的T细胞表面，可以与抗原呈递细胞(APC)表面的B7分子高亲和力结合，将CTLA- 4编码序列与抗原连接构建的DNA疫苗免疫小鼠，在没有佐剂的情况下即可增强体液和细胞免疫[9]。只保留细胞外CTLA- 4结构域不影响其与受体分子结合的能力。抗原与CTLA- 4胞外区共表达， 尤其是在大动物的DNA免疫实验中，可显著增强DNA疫苗的免疫原性[10]。

 

A.IgG antibody titers detected by ELISA; B.IFN-γ secreting splenocytes from immunized mice; C.IL- 4 secreting splenocytes from immunized mice; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; SFC.spot forming cells

图4 各免疫组血清抗体效价以及分泌细胞因子分析Fig 4 Antibody titers and secretion cytokines analysis of immunized n=4)

  

图5 间接免疫荧光分析(IFA)DNA疫苗小鼠免疫血清抗体(1∶200稀释)识别恶性疟原虫体抗原

 

Fig 5 Recognition of Plasmodium falciparum antigen with antiserum antibody from DNA vaccine immunizedmice (dilution 1∶200) by indirect immunofluorescence assay(×1 000)

增强机体对DNA疫苗免疫应答的另一种方法是加入分子佐剂，即在设计DNA疫苗时引入细胞因子、趋化因子或共刺激分子的编码序列，即所谓的基因佐剂(genetic adjuvant)。GM-CSF是DNA疫苗研究中使用较多的一种基因佐剂。GM-CSF可以将APC招募到抗原处理部位，刺激骨髓DCs成熟，加强抗原特异性的CD8+T细胞反应。GM-CSF在临床上的应用也已经证实是安全的，一项以GM-CSF为基因佐剂针对疟原虫肝期的五价DNA疫苗临床研究也表明，GM-CSF在人体应用是安全可靠的[2]。

疟疾感染者获得保护性与感染早期IFN-γ以及Th2细胞介导的IL- 12、IL- 4反应以及抗体类别向IgG转换密切相关[11]。前期工作中构建了胞内表达型恶性疟原虫红内期疟疾核酸疫苗[3]，为了进一步提高DNA疟疾疫苗经肌肉途径的免疫效力，本研究将DNA疫苗载体改造为分泌型表达，同时采用CTLA- 4靶向DCs的融合表达设计。结果显示，分泌型DNA疫苗免疫小鼠明显增强了细胞因子IFN-γ和IL- 4的分泌，说明分泌型抗原增加了与APC细胞接触的概率，能更有效的刺激细胞免疫；且CTLA- 4融合表达增加了抗原分子对局部DCs表面吸附能力，促进了DCs摄取抗原的效率，进一步加强了体液和细胞免疫。另一方面， GM-CSF对DNA疫苗免疫有显著的刺激机体产生持久系统免疫反应的佐剂效应[12]，本研究结果也显示，在GM-CSF的基因佐剂的参与下，可明显增强DNA疫苗的免疫应答，游离疟疾抗原在CTLA- 4靶向作用以及GM-CSF的基因佐剂共同作用下，抗体滴度提高了190倍。

在总体建筑工程中，计算机的引用可以有效避免很多事故的发生，利用计算机编排的程序，可以快速检测建筑的各项数据以及对建筑的实际情况做具体研究。在建筑建设过程中，计算机对整体建筑系统的运作起着不小的作用。把建筑信息化，有利于建筑的整体规划，不妥的地方都可以直观地展现出来，并且在一些特定的地方，信息化的建筑还可以为工程师提供灵感，使建筑的综合性能得到提升。

1.2.4 活体电穿孔免疫：SPF级6～8周雌性Balb/c小鼠，体质量18～20 g(中国医学科学院实验动物研究所)，随机分为6组：VR1012-ES312组、VR1012-sES312组、VR1012-sES312-CTLA组、VR1012-sES312+GM-CSF组、VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF组，以空载体VR1012为对照免疫组。每组免疫5只小鼠。核酸疫苗电穿孔免疫方法参照文献[3]进行操作，每种质粒注射量50 μg/只小鼠，总共免疫4次，间隔两周。

DNA 疫苗是近年来发展起来的新型疫苗，导入机体后表达出抗原蛋白可通过MHC-Ⅰ以及MHC-Ⅱ途径呈递，激活CD4和CD8+T细胞，诱导产生体液免疫和细胞免疫反应[6]。DNA疫苗研究普遍采用导入肌肉组织中进行免疫，但肌肉细胞并不是专职的抗原呈递细胞(APCs)，无法引起强烈的特异性免疫应答；由DCs将DNA编码抗原呈递给T细胞是DNA疫苗免疫反应中的关键事件[7]。然而，组织中DCs占有核细胞总数的比例不到1%，且DNA疫苗经普通的肌肉免疫途径免疫小鼠，只有大约0.4%的DCs能够被转染[8]。这些因素使得DNA疫苗免疫效果尚不能完全令人满意。

上海南洋公学，即今上海交通大学的前身。1896年由盛宣怀创建于上海，与北洋大学堂同为中国近代史上最早创办的大学；1905年更名为“商部上海高等实业学堂”；1907年更名为“邮传部上海高等实业学堂”；辛亥革命后1911年到1912年间为“南洋大学堂”；1912年中华民国成立后，更名为“交通部上海工业专门学校”；1921年更名为“交通大学”。[2]45

[1] Spearman P, Mulligan M, Anderson EJ, et al. A phase 1, randomized, controlled dose-escalation study of EP-1300 polyepitope DNA vaccine against Plasmodium falciparum malaria administered via electroporation [J]. Vaccine, 2016, 34: 5571- 5578.

韩国于1973年2月公布了专门的《少额案件审判法》，该法的立法宗旨是“在妥当性与迅速性当中注重民事诉讼的迅速性，从而更简易、经济地处理案件。注重迅速性能够给诉讼当事人带来利益，而且在处理轻微的案件时不会造成太多的因牺牲妥当性而带来的损害”，“从而使一般国民能够方便、迅速地解决私人间的民事纠纷。”［9］

江西省报经国务院同意，建立了河湖长制表彰奖励制度。江苏省印发《江苏省河长制湖长制工作2018年度省级考核细则》，把河湖长制工作年度考核结果作为党政领导干部综合考核评价重要依据。浙江省《2017年度河长制长效机制考评细则》《2017年度“五水共治”（河长制）工作考核评价指标体系及评分细则》也把河长履职考核情况列为干部年度考核述职内容，作为领导干部综合考核评价的重要依据。湖北省将全面推行河湖长制纳入2018年度对市州党委政府目标责任制考核项目清单，考核结果与生态环境损害责任追究、干部选拔任用、“奖补资金”安排挂钩。

[3] 高宇辉, 邓唯唯, 张佳佳, 等. 活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究 [J]. 医学研究杂志, 2016, 45: 19- 24.

（d）The house where I used to live has been knocked down.

[5] Wang J, Lin Y, Cai P, et al. Effects of vector fusion peptides on the conformation and immune reactivity of epitope-shuffled, recombinant multi-epitope antigens [J]. Protein Pept Lett, 2011, 18: 73- 83.

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(3)SiH4(硅烷)法生产高纯多晶硅是非常优异的方法。用粗硅作原料,熔融电解法制取硅烷原理如下页图7,电解时阳极的电极反应式为____。