子宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，位于女性癌症死亡原因的第二位。有研究表明2012年全世界有约527 600子宫颈癌新发病例，约265 700例患者死于该病[1]。近年来，随着免疫学技术的发展，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)疫苗逐渐成为预防子宫颈癌发生的有效方式[2]。根据疫苗的用途可以分为治疗性疫苗和预防性疫苗，预防性疫苗对宫颈上皮内瘤变和子宫颈癌患者几乎没有治疗作用，由于治疗性疫苗在对抗肿瘤的发生和进展中的重要作用，正日益成为研究的重点[3]。DNA疫苗是治疗性疫苗的重要类型，现以国内外DNA疫苗的研究现状和进展作一综述。

1 DNA疫苗的作用方式

DNA疫苗是一种核酸疫苗，主要成份是含有可编码蛋白质抗原的DNA片段。通过抗原的表达激活体内的免疫应答反应，从而对抗肿瘤的发生和进展。早在1990年Wolff等人就发现质粒DNA通过肌内注射(intramuscular injection，IM)后可以长时间表达，随后又有研究发现DNA片段导入体内可以作为一种免疫手段诱导特异性免疫应答，从而奠定了DNA疫苗的理论基础[4]。

HPV的持续感染是子宫颈癌发生和发展的重要原因，研究表明HPV复制过程中产生的HPV E5蛋白可以导致DNA损伤后细胞凋亡的减少，而HPV E6蛋白可减少抑癌基因P53产物TP53的量，最终导致细胞的增殖紊乱及恶化，诱导肿瘤的发生。HPV E6和E7作为肿瘤特异性抗原，在子宫颈癌变的整个过程中都可持续表达，并且是影响宫颈上皮恶性化形成至关重要的分子[5]。子宫颈癌DNA疫苗最重要的成分是可在体内稳定表达的含有E6和(或)E7 DNA片段的质粒DNA，疫苗可以激发人体针对这类抗原的特异性免疫应答，通过特异性T细胞对抗原的高亲和力清除HPV相关损伤，从而达到攻击肿瘤细胞治疗子宫颈癌的目的[6]。

子宫颈癌DNA疫苗接种于人体后通过宿主细胞大量表达蛋白抗原，被树突状细胞(dendritic cells, DCs)或体细胞摄取(图1)。①摄取的DNA通过体细胞或DCs表达相关抗原在DCs内形成内体，通过MHCⅡ分子呈递激活CD4+T细胞，另外抗原可通过交叉提呈的方式与MHCⅠ分子形成抗原肽MHCⅠ类分子复合物，经高尔基体转运至包膜，激活CD8+T细胞。②DCs摄取的疫苗DNA直接形成内源性抗原通过蛋白酶体降解形成肽段后转运至内质网形成抗原肽MHCⅠ分子复合物，再经高尔基体转运至包膜，激活CD8+T细胞。CD4+T细胞可以促进CD8+T细胞的活化，效应细胞转运至宫颈病变部起到杀伤肿瘤的作用[2]。疫苗的质粒DNA含有未甲基化的CpG二核苷酸模体，它能作为配体刺激Toll样受体(toll-like receptors, TLR)，促进免疫应答的激活。多种免疫细胞表面表达TLR9，如DCs、B细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)等，疫苗的质粒DNA能够促进这些免疫细胞的活化，增强免疫应答[6]。由于CpG序列的增多可以激活免疫应答过程，近年有人在DNA疫苗中的质粒骨架中嵌入CpG序列以促进CpG在体内的表达，明显提高疫苗的效能[6]。

注：vaccine：疫苗； myocyte：肌细胞； antigen：抗原； phagocyte：巨噬细胞； DCs：树突状细胞； proteasome：蛋白酶体； peptide：肽段； broken tumor：破坏的肿瘤碎片； Li Li链：MHC 主要组织相容性复合物 图1 子宫颈癌DNA疫苗的作用方式

2 治疗性HPV DNA疫苗的优化

根据近年的流行病学调查发现，引起宫颈肿瘤的高危HPV中，HPV16和HPV18为最常见的亚型，并且HPV16在不同地区和不同肿瘤级别中占有更大的比例[7]。在对抗单一HPV亚型诱导形成的肿瘤，更多人首先选择的是感染率更高的HPV16，所以目前治疗性疫苗研究最常见的是含有HPV16亚型E6/E7片段的DNA疫苗。随着免疫学技术的不断进展，包含其他病毒亚型的抗原表位也更多被涉及到。多数DNA疫苗在质粒DNA中嵌入各类“载体蛋白”，通过这些“载体蛋白”的表达来提高免疫原性，以此提高杀伤肿瘤的效果[6] (表1)。

表1 DNA疫苗类型和免疫效果

HPV型别疫苗结构免疫效应参考文献HPV16Kozak序列+J-Domain+HPV16 E6/E7 mixed shuffled+SV40增强子基因转染率提高;提高MHCⅠ交联反应和交叉激活CTLs;混合重组序列无感染能力[8]HPV16LYCYE motif+HPV16 E7突变体抗原特异性CTLs激活增加;TH1细胞因子、IFN-γ、TNF-β量增加;TH3细胞因子、TGF-β量减少;细胞免疫反应强,抗肿瘤作用强[6]HPV16/HPV18pcDNA/E7+HSP70激活特异性免疫应答,动物模型肿瘤体积明显减小[6]HPV16pCTLA4-E7E6相比未融合CTLA4有更高的肿瘤相关免疫应答反应[10]HPV16pE7+IL-2 cDNA+anti-4-1BB Abs激活E7特异性CTLs;肿瘤治愈率增高;长效免疫记忆力[6]HPV16AR-42+CRT/E7增加MHCⅠ/MHCⅡ分子表达量;促进E7特异性CTLs[6]HPV16OML-HPV16 E6/E7激活特异性CTLs[6]HPV16pNGVL4a-hCRTE6E7L2诱导E6/E7特异性CD8+T细胞应答和抗肿瘤效应,在动物模型中皮下肿瘤的生长受到抑制而且循环肿瘤细胞消失,无需CD4+T细胞的辅助[6]

注：MHC I：主要组织相容复合体Ⅰ； CTLs：细胞毒性T淋巴细胞； IFN-γ：干扰素γ； TNF-β：肿瘤坏死因子β； CTLA4：细胞毒性淋巴细胞相关抗原4

利用病毒的部分抗原成份也是有效促进疫苗效能的一种方式，比如Bissa等人将鸡痘病毒和HPV16 E6减毒体重组构建疫苗，或有人利用乙肝病毒表面抗原(HBsAg)构建重组DNA疫苗，它们在一定程度上增强了免疫应答[6]。虽然这些疫苗的DNA片段保留大多数抗原表位，但是经检测发现不具有恶性转化的能力。有研究显示融合E6和E7基因的疫苗诱导免疫的效果明显高于只含有E6或E7基因的疫苗，充分显示良好的重组序列能够更好的诱导免疫反应的发生[8]。

疫苗产生的免疫杀伤效果在多个小动物模型当中得到证实，但人体内效率却不高，这与DNA疫苗在接种部位的表达量缺乏和原位组织细胞内抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs )量不够充足有关[3]。目前物理方法也可增加DNA疫苗的表达和呈递效率，比如基因枪、喷射注射、电穿孔、糖脂包被、聚合物和纳米粒子等。其中运用最为广泛的是电穿孔技术，它是利用高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，将疫苗DNA导入体细胞或抗原呈递细胞，增加抗原的表达量以此增强特异性免疫应答[9]。根据美国国立卫生研究院(ClinicalTrials.gov)的数据显示，HPV疫苗的临床试验研究数量高达两百多例，其中子宫颈癌DNA疫苗进入临床试验阶段的也有数十例(表2)。

该文选取64例妊娠糖尿病病患做为研究对象，按照随机方法，将患者分为研究组和对照组，每组32例患者。 研究组患者年龄22～39岁，平均年龄（29.3±4.3）岁；孕周 22～34 周，平均孕周（27.6±2.5）周；其中有 23 例初产妇，9例经产妇。对照组患者年龄22～38岁，平均年龄（28.9±4.1）岁；孕周 22～35 周，平均孕周（28.2±2.7）周；其中有24例初产妇，8例经产妇。比较两组患者的基本资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

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佐剂作为一种非特异性免疫增强剂，在疫苗中运用广泛。对于子宫颈癌DNA疫苗来说，免疫原性偏低一直是限制其发展最重要的原因，免疫佐剂的加入可弥补这类疫苗的缺陷[8]。细胞因子是一种重要的免疫佐剂，在辅助DNA疫苗激活免疫应答过程中起到良好作用，具备强大诱导特异性CD4+/CD8+T细胞应答的能力。白细胞介素33(interleukin 33，IL-33)已经被证明在子宫颈癌DNA疫苗当中可以起到正向促进免疫应答的功能[6]。除此之外，多种细胞因子能作为疫苗佐剂，如IL-12、IL-15、IL-28B、趋化因子配体27/CTACK(chemokine ligands，CCL27)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein，MIP1-α)等[9]。

表2 DNA疫苗临床试验情况

NCT ID分期状态研究名称生物学特点目的NCT00685412Ⅰ完成第一阶段人类乳头状瘤病毒(HPV)DNA质粒(VGX-3100)+电穿孔在CINⅡ或Ⅲ的研究VGX-3100, DNA质粒IM+EP安全性、耐受性和体液免疫和细胞免疫应答NCT01634503Ⅰ完成GX-188E DNA治疗性疫苗通过电穿孔治疗CINⅢ的安全性GX-188E+EP安全性、免疫原性NCT01304524Ⅱ进行一个VGX-3100 DNA疫苗通过电穿孔治疗CINⅡ/Ⅲ的研究VGX-3100, DNA质粒IM+EP组织病理退化和病毒清除NCT02100085Ⅰ进行治疗性疫苗通过电穿孔策略的安全性和有效性GX-188E+EP NCT01634503后续研究免疫应答和损伤状态和Ⅰ期相比NCT00685412Ⅰ完成临床Ⅰ期HPV DNA质粒(VGX-3100)通过电穿孔策略治疗CINⅡ/ⅢVGX-3100, DNA质粒IM注射+EP安全性、耐受性、体液和细胞免疫应答NCT00121173Ⅰ/Ⅱ完成疫苗治疗在阻止CIN患者转换为宫颈癌的研究疗效pNGVL4a-Sig/E7(减毒)/HSP70 DNA疫苗最佳剂量、副作用NCT00199849Ⅰ完成NY-ESO-1质粒DNA(pPJV7611)肿瘤疫苗NY-ESO-1质粒DNA肿瘤疫苗+PMED免疫原性、有效性

注：CIN：宫颈上皮内瘤变； EP：电穿孔； VGX-3100：临床研究较好的DNA疫苗，2012年Ⅰ期临床试验结果显示通过EP介导的方式此种疫苗的安全性、耐受性和免疫原性都有一个良好的结果； 疫苗对CINⅡ/Ⅲ患者可诱发强有力的免疫反应，并且有效阻止疾病的进一步发展[6]。

3 DNA疫苗的优劣势

DNA疫苗作为一种核酸类疫苗与其他类型疫苗相比具备很多优势：①无MHC限制性可反复免疫；②可有效激活固有免疫；③来源方便，可设计不同的DNA片段；④稳定性高，降低了储存和运输成本[3]。不过DNA疫苗也有自身的不足：①裸DNA疫苗被机体吞噬后，在吞噬溶酶体和胞浆中易被多种酶降解，使其在胞浆中半衰期较短，从而降低DNA疫苗转染效率、靶抗原的表达水平及抗原呈递效率；②DNA疫苗进入机体后，不能被专职APCs如抗原呈递能力最强的DCs等特异捕获，降低抗原呈递效率；③DNA疫苗对非专职APCs的转染可导致T细胞对该抗原的耐受；④疫苗携带的DNA片段可能会插入到正常细胞DNA中，有基因突变的风险[3]。E6/E7蛋白作为DNA疫苗的靶抗原，免疫原性低下一直是影响疫苗最终效果的主要原因[11]，目前多种DNA疫苗都旨在增加其免疫原性，通过携带一些免疫调节物质和细胞靶蛋白来增加交叉呈递和刺激免疫细胞的能力。

4 展望

DNA疫苗的研究发展迅速，但可广泛运用于临床的治疗性DNA疫苗还有待进一步研究确定。疫苗的质粒DNA构建，需要寻找靶抗原E6、E7 DNA的优势序列，使其表达更多抗原表位并且失去恶性转化的能力。其次，需要增加DNA疫苗体内表达量和高效靶向抗原呈递细胞。目前纳米材料构建载体系统也处于研究阶段，多数研究证明其可增加DNA疫苗的免疫原性[12]。另外有人将微型针头与聚电解质多层技术结合，把聚合物材料制成疫苗“补丁”，这种采用微型针头的多层技术所引发的免疫反应能大大超过DNA疫苗的直接注射或是电穿孔，更能提高记忆T细胞增殖，并且还具有基因表达量高等优势[13]。DNA疫苗与放化疗或者其他免疫制剂合理配合使用也是今后重要的研究方向。目前发现疫苗和放化疗可互相促进加强治疗效果，这提示今后免疫治疗与传统治疗手段结合的综合治疗可成为宫颈癌治疗的一种有效方法[6]。

目前疫苗的研究多集中于HPV16和HPV18感染的子宫颈癌，HPV感染流行病学调查显示HPV58型感染形成的子宫颈癌在我国也占有很大比例，疫苗种类的研发需要结合我国的感染现状。现已有研究人员成功构建HPV58相关肿瘤的治疗性疫苗，并取得了一些成效，但还需要进一步的实验研究[6]。今后DNA疫苗应该在提高其免疫原性，避免免疫耐受，延长其免疫记忆，提高疫苗转染效率等方面做出更多的努力，相信在不久的将来运用疫苗治疗宫颈癌可以达到一个满意的效果。

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