乳腺癌是女性恶性肿瘤中最为高发的一种，对全球女性的身体健康造成极大威胁，目前我国乳腺癌的发病率在女性恶性肿瘤中排名第1位。乳腺癌治疗重要手段之一是化疗，临床调查显示，存在近一半的乳腺癌患者初期对于化疗无显著效果，从而治疗失败导致复发或转移。造成化疗失败的原因有多种，其中最主要的是肿瘤细胞耐药性的产生[1-3]。

微小非编码RNA(microRNA)是一类广泛存在于生物体内长度约为22nt的微小非编码RNA，通过与特异性靶基因的3’UTR配对，从而发挥靶基因调节作用[4，5]。作为乳腺癌治疗的潜在靶点，多种miRNA近年来被发现参与了恶性肿瘤化疗敏感性的调节。研究发现，miR-34a与多种化疗药物肿瘤耐药性的调节有关[6，7]，例如在结直肠细胞中，依托泊甙敏感性下降与miR-34a的水平下调密切相关，过表达miR-34a可提高消化道肿瘤对依托泊甙的敏感性[8，9]。但在乳腺癌的治疗中，miR-34a能否增加相关化疗药物敏感性的研究目前少有报道。因此，本章旨在探讨miR-34a在紫杉醇处理乳腺癌细胞过程中产生的生物学行为，并探讨其潜在可能的分子机制。

综上，格伦德曼不仅批驳了西方环保主义者曲解“支配自然”观念的理论根源，而且还对马克思的“支配自然”观念作了积极解读和有力辩护。格伦德曼对“支配自然”观念的积极阐释具有重大而深远的理论价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

使用人乳腺癌细胞株MCF-7，购自于武汉大学基础医学院。

为了明确miR-34a提高MCF-7细胞对紫杉醇药物敏感性的作用机制，通过Western blot检测乳腺癌干细胞标志物ALDH1的变化，分别于不同转染组中加入50 nM紫杉醇或相应溶媒，并处理72 h。Western blot结果显示：在加入miR-34a+DMSO组中，乳腺癌干细胞标志物ALDH1的表达受到明显抑制，而在miR-34a与紫杉醇联用组中抑制作用更显著(见图4)，与相应对照组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.01)，表明miR-34a过表达联合紫杉醇的情况下，能明显抑制乳腺癌细胞干性。

低温高速离心机(Thermo Fisher公司，美国)；酶标仪(PerkinElmer公司，美国)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher公司，美国)；BCA蛋白浓度检测试剂盒 (北京天根生物公司，中国)；多西紫杉醇(Sigma公司，美国)；胎牛血清(Gibco公司，美国)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司，美国)；0.25%胰蛋白酶(Sigma公司，美国)。

1.2 方法

细胞溶解产物冰浴30 min，4℃以10 000 rpm×10 min离心，取上清置于-80℃冰箱储存。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。通过不同处理得到的蛋白质样本进SDS-PAGE实验将蛋白电泳分离，然后经转膜、封闭后，单抗以1∶1 000在4℃孵育过夜，后以辣根过氧化物歧化酶标记的二抗1∶5 000室温孵育1 h，化学发光检测系统进行检测，以GAPDH作为参比。

该模块在结构上与各职能部门信息管理子系统平级，介于用户管理模块与知识档案管理模块之间。其主要任务是为各级各类用户提供查询界面及相应数据处理模型。

将乳腺癌细胞分为4组：分别为miR-Ctrl+溶媒组、miR-34a+溶媒组、miR-Ctrl+紫杉醇组和miR-34a+紫杉醇组。

1.2.4 Western blot检测ALDH1蛋白

在每组转染相应质粒24 h后，在96孔板上接种细胞，乳腺癌细胞增殖能力采用CCK-8试剂盒进行检测。具体步骤为：将处于对数期生长期的乳腺癌MCF-7细胞用胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的细胞培养液调整细胞密度至2×104/mL，取100 μL细胞悬液分别加入到96孔板中，每孔设置3个复孔，不同组细胞经转染后，在孔边缘加入等量无菌D-Hank’s液，置于5% CO2的细胞培养箱中培养4～6 h。去除原有培养基，每孔加入新的完全培养基200 μL，待细胞贴壁后，在不同时间点分别加入10 μL的CCK-8溶液测定细胞活性，以仅加入CCK-8溶液和培养基的孔作为空白对照，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光值(OD值)。

由于该带式输送机系统由2个滚筒驱动，按DTⅡ型固定式带式输送机设计选用手册计算，输送机工作时不打滑所需保持的最小静张力为：F1≤F2eμ(φ1+φ2)。对于CST驱动装置，取KA=1.1，则Fmin=88.2 kN。

取处于对数生长期的MCF-7细胞，制备浓度为2×104个/mL的细胞悬液，以(2 mL/孔)将细胞接种于6孔板后，再加入含有20 ng/mL 表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)、20ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、0.4%牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)、2% B27和10 μg/mL胰岛素的无血清培养基，根据细胞长成情况约每3天进行一次换液。培养10 d后将6孔板置于倒置显微镜下进行观察，计数直径大于50 μm的乳腺球数量。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力

1.2.1 细胞分组

1.2.5 双荧光素酶实验

1.2.3 乳腺球形成实验

（一）用趣味性的材料激发学生思考。例3：在学习《灿烂的中华文化》时，笔者播放相声演员苗阜的作品《学富五车》，让学生捧腹不已，笔者借机引导：“这相声的段子里包含哪些灿烂的中华文明？”学生在欢快的情绪中积极思考，他们的回答就是对信息的解读。

1.3 统计学分析

所有数据均采用均数±标准差表示，使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 miR-34a对紫杉醇处理MCF-7细胞的IC50的影响

经转染24 h后，向不同转染组的MCF-7细胞中分别加入紫杉醇溶液，使其终浓度分别为0、12.5、25、50、100、200 nM，然后继续培养乳腺癌细胞48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL进行CCK-8法测定，酶标仪测定OD 450值，并计算不同组细胞紫杉醇的抑制率和IC50。结果显示，转染miR-34a模拟物(miR-34a mimics)后，紫杉醇对MCF-7细胞的抑制率显著提高，同时显著降低其IC50(P<0.05)，表明miR-34a过表达能增加乳腺癌MCF-7细胞对紫杉醇的化疗敏感性(见图1)。

消化并接种细胞于35 mm细胞培养皿，置于5% CO2、37℃培养箱内培养过夜，细胞密度达到70%时用Luciferase报告基因质粒、LacZ的表达质粒共转染细胞，转染24～36 h后，吸去培养液，采用冰浴的PBS洗涤细胞。在每个培养皿中加入350 μL预冷的harvest buffer，冰浴10 min以裂解细胞。将ATP buffer与luciferin buffer以1∶3.6比例混合配成反应液后分装，每管100 μL。取等体积的细胞裂解液(100 μL)与反应液混合，迅速混匀后在发光仪(Luminometer)上读取吸光值。

注：A：miR-34a过表达组与对照组的抑制率曲线； B：miR-34a过表达组与对照组IC50 的比较，与miR-Ctrl组相比，*P<0.05 图1 miR-34a过表达对紫杉醇处理MCF-7细胞IC50的影响

2.2 miR-34a与紫杉醇对MCF-7细胞增殖的抑制作用

不同组细胞经转染后24 h，分别加入50 nM的紫杉醇溶液或相应溶媒，采用CCK-8法检测每组细胞于不同时间点的细胞活力并绘制生长曲线。miR-34a组和紫杉醇组细胞活性均明显降低，即miR-34a与紫杉醇均能抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力。而miR-34a+紫杉醇组对MCF-7细胞增殖能力的抑制程度更为明显，且与其他组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明，miR-34a可提高紫杉醇对MCF-7细胞增殖能力的抑制作用(见图2)。

在互联网技术高速发展的时代，高校教育信息化已经成为一种必然的趋势，这其中以MOOCs为代表的在线课程开发模式受到越来越广泛的应用。由于MOOCs对传统教学理念进行了大胆的变革，契合了新时代下人们对教育的重新审视与认识，让传统的教学进入了一个全新的阶段，同时也给高校教育教学带来了新的挑战。传统教育教学如何合理地利用MOOCs进行教与学，促进教学质量的提升，已成为高校教育教学中需要更深入研究和更广泛探索的问题。

注：与miR-34a抑制组相比，*P<0.05，**P<0.01 图2 CCK-8法检测各组MCF-7细胞的活力

2.3 miR-34a与紫杉醇对MCF-7细胞自我更新能力的影响

不同转染组细胞在50 nM(终浓度)的紫杉醇或相应溶媒的无血清培养液中培养10 d左右，置于显微镜下，观察每组细胞乳腺球的形成状态。结果显示MCF-7细胞在单纯使用紫杉醇的情况下，乳腺球整体大小和形成效率没有受到较大影响；而与miR-34a联用则可观察到乳腺球大小和形成效率均受到了显著抑制，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明miR-34a可能是通过影响细胞的自我更新能力从而提高MCF-7细胞对紫杉醇的化疗敏感性(见图3)。

2.4 miR-34a与紫杉醇对MCF-7细胞中ALDH1的表达影响

1.1.2 主要仪器和试剂

注：A：不同处理组乳腺球体积变化(400×，scale bar=100um)； B：不同处理组乳腺球计数，与miR-Ctrl+DMSO组相比，*P<0.05，与miR-Ctrl+PTX组相比，**P<0.01) 图3 miR-34a与紫杉醇处理对MCF-7细胞乳腺球形成的影响

注：A：不同处理组ALDH1代表性的Western blot条带； B：不同处理组中ALDH1相对蛋白表达量，与相应的miR-Ctrl组相比，**P<0.01 图4 miR-34a与紫杉醇处理对MCF-7细胞中ALDH1蛋白表达的影响

2.5 miR-34a对WNT7A直接靶向作用

我们通过TargetScan和StarBase等预测网站进行了生物信息学预测，结果得出miR-34a可与转录因子WNT7A的3’UTR端相互结合。TargetScan(http://www.targetscan.org/)及StarBase(http://http://starbase.sysu.edu.cn/)显示miR-34a与WNT7A mRNA的3’UTR之间存在互补配对序列。为了进一步验证miR-34a与WNT7A是否存在直接靶向作用关系，将不同质粒共转染MCF-7细胞48 h后进行双荧光素酶实验验证。

注：A：软件预测结合部位； B：不同组WNT7A-3’UTR双荧光素酶检测对比，与NC-miRNA组对比，**P<0.01 图5 miR-34a与WNT7A的靶向作用关系

结果表明共转染miR-34a mimics和WNT7A-Wt-3’UTR的MCF-7细胞中荧光素酶活性强度显著低于对照组(P<0.01，见图5)。说明miR-34a可抑制野生型WNT7A mRNA 3'UTR的荧光素酶活性，miR-34a与WNT7A存在直接靶向作用关系。

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3 讨论

近年来，由于治疗技术的不断发展以及防癌措施的普及，乳腺癌的发病率呈下降趋势。迄今为止，复发、转移及对放化疗的耐受导致乳腺癌患者仍存在较高的死亡率。因此，寻找新的可行的针对乳腺癌细胞对化疗药物产生耐药的诊治方法一直是目前乳腺癌研究的重点和热点。紫杉醇被认为是最为有效和常用的化疗药物，但由于耐药性的出现导致其治疗效果不佳。肿瘤出现耐药性的情况和机制非常复杂，涉及到多基因、多药物靶点等方面的改变。基因的突变、缺失或miRNA的调控均对耐药性产生一定的影响[10]。

乳腺癌耐药的发生机制相当复杂，很多研究证明是多种机制联合作用的结果。这些机制包括：①膜转运蛋白高表达状态；②药物转运及活化障碍；③药物靶点质与量改变；④细胞酶系统改变；⑤DNA修复功能改变；⑥细胞凋亡受到抑制；⑦激素受体数量减少等[11，12]。但是，其耐药具体机制尚未完全明确。乳腺癌的耐药是一个涉及多种基因调控、含有多个步骤的复杂过程，虽然目前明确了miRNA的表达在其中发挥了重要作用，但关于miRNA发挥其相关调控作用的分子机制目前仍未研究清楚[13]。紫杉醇是常见的也是非常重要的众多乳腺癌化疗药物之一，许多化疗方案中都采用了紫杉醇，紫杉醇与阿霉素、靶向类药物是乳腺癌治疗的经典药物，两者的联用极大改善了乳腺癌的治疗效果，明显降低了乳腺癌患者的复发率和转移率，提高了患者远期生存率，这一点在许多临床试验中得到了证实[14-16]。

Zhang等研究发现miR-100能通过靶向抑制mTOR信号通路，进而增强Luminal A型乳腺癌细胞对紫杉醇化疗的敏感性[17]。Xue等研究发现miR-621通过抑制FBXO11基因和增强P53活性，增强乳腺癌细胞的化疗敏感性[18]。Liu等研究发现在三阴性乳腺癌细胞中，miR-101通过抑制MCL-1表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖，增强三阴性乳腺癌细胞对紫杉醇治疗的敏感性[19]。Tang等发现miR-16通过抑制IKBKB表达，增强乳腺癌细胞对紫杉醇化疗的敏感性[20]。

在本研究中，我们发现转染miR-34a mimics后，紫杉醇对MCF-7细胞的抑制率显著提高，同时显著降低其IC50。这些结果表明miR-34a能增强乳腺癌细胞株MCF-7对紫杉醇的化疗敏感性，这与Kang、Ma等研究结果[21，22]一致。同时，miR-34a组和紫杉醇组细胞活性均降低，紫杉醇和miR-34a联合使用组对MCF-7细胞增殖能力的抑制效果更为显著。且在单纯使用紫杉醇的情况下，乳腺球整体大小和形成效率无明显影响，而联用组中乳腺球大小和形成效率均受到了显著抑制，以上表明miR-34a提高紫杉醇化疗敏感性的机制之一可能是通过影响乳腺癌细胞的自我更新能力来实现的。本研究还发现，miR-34a与紫杉醇联用可显著抑制乳腺癌干细胞标志物ALDH1的水平。通过双荧光素酶实验我们发现miR-34a靶向作用WNT7A。综上所述，miR-34a通过靶向调控WNT信号通路，进而抑制乳腺癌细胞的自我更新能力和肿瘤细胞干性，从而提高乳腺癌细胞对紫杉醇的化疗敏感性。

实验期间,各组动物行动灵活，反应敏捷，被毛整洁，眼鼻口无分泌物，进食饮水正常，生长发育良好，无异常行为和中毒症状，无死亡。

参考文献：

[1] Pinto C A, Widodo E, Waltham M, et al． Breast cancer stem cells and epithelial mesenchymal plasticity-Implications for chemoresistance[J]．Cancer Lett,2013,341(1):56-62．

[2] Lonning P E. Molecular basis for therapy resistance[J]． Mol Oncol,2010, 4(3):284-300．

[3] Cascorbi I. Role of pharmacogenetics of ATP-binding cassette transporters in the pharmacokinetics of drugs[J]． Pharmacol Ther,2006,112 (2):457-473．

[4] Ebert M S, Sharp P A. Roles for microRNAs in conferring robustness to biological processes[J]． Cell, 2012,149(3):515-524．

[5] Rottiers V, Näär A M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders[J]．Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13(4):239-250．

[6] Mastropasqua F, Marzano F, Valletti A, et al.TRIM8 restores p53 tumour suppressor function by blunting N-MYC activity in chemo-resistant tumours[J]． Mol Cancer, 2017,16(1):67．

[7] Bach D H, Hong J Y, Park H J, et al.The role of exosomes and miRNAs in drug-resistance of cancer cells[J]． Int J Cancer,2017,141(2):220-230．

[8] Akao Y, Noguchi S, Iio A, et al. Dysregulation of microRNA-34a expression causes drug-resistance to 5-FU in human colon cancer DLD-1 cells[J]． Cancer Lett,2011,300(2):197-204．

[9] Sun C, Wang F J, Zhang H G， et al. miR-34a mediates oxaliplatin resistance of colorectal cancer cells by inhibiting macroautophagy via transforming growth factor-β/Smad4 pathway[J]． World J Gastroenterol,2017, 23(10): 1816-1827．

[10] Pitt J M, Vétizou M, Daillère R, et al. Resistance mechanisms to immune-checkpoint blockade in cancer: tumor-intrinsic and extrinsic factors[J]． Immunity,2016,44 (6):1255-1269．

[11] Patel H K, Bihani T. Selective estrogen receptor modulators (SERMs) and selective estrogen receptor degraders (SERDs) in cancer treatment[J]．Pharmacol Ther,2018,186: 1-24．

[12] Osborne C K, Schiff R. Mechanisms of endocrine resistance in breast cancer[J]． Annu Rev Med,2011,62(1): 233-247．

[13] Hu W, Tan C, He Y, et al. Functional miRNAs in breast cancer drug resistance[J]． Onco Targets Ther,2018,11:1529-1541．

[14] Martín M. nab-Paclitaxel dose and schedule in breast cancer[J]． Breast Cancer Res, 2015，17(1):81．

[15] Ueno N T, Mamounas E P. Neoadjuvant nab-paclitaxel in the treatment of breast cancer[J]． Breast Cancer Res Treat,2016,156(3): 427-440．

[16] Zhou L, Xu S, Yin W, et al. Weekly paclitaxel and cisplatin as neoadjuvant chemotherapy with locally advanced breast cancer: a prospective, single arm, phase II study[J]． Oncotarget, 2017, 8 (45):79305-79314．

[17] Zhang B T, Zhao R R, He Y, et al. Micro RNA 100 sensitizes luminal a breast cancer cells to paclitaxel treatment in part by targeting mTOR[J]．Oncotarget,2016,7(5): 5702-5714．

[18] Xue J, Chi Y, Chen Y, et al. MiRNA-621 sensitizes breast cancer to chemotherapy by suppressing FBXO11 and enhancing p53 activity[J]．Oncogene,2016,35(4): 448-458．

[19] Liu X P,Tang H L,Chen J P, et al. MicroRNA-101 inhibits cell progression and increases paclitaxel sensitivity by suppressing MCL-1 expression in human triple-negative breast cancer[J]．Oncotarget,2015,6(24): 20070-20083．

[20] Tang X Y, Jin L, Cao P G, et al. MicroRNA-16 sensitizes breast cancer cells to paclitaxel through suppression of IKBKB expression[J]．Oncotarget,2016,7(17): 23668-23683．

[21] Kang L, Mao, Tao Y, et al. MicroRNA-34a suppresses the breast cancer stem cell-like characteristics by downregulating Notch1 pathway[J]．Cancer Sci, 2015,106(6): 700-708．

[22] Ma W, Xiao G G, Mao J, et al. Dysregulation of the miR-34a-SIRT1 axis inhibits breast cancer stemness[J]．Oncotarget,2015,6(12):10432-10444．