缺血性中风是世界范围内人类死亡和长期残疾的主要原因之一[1] 。其中，炎症反应贯穿于缺血性脑损伤的整个病理过程中，于缺血后数小时至几天达高峰，是影响中风预后的主要因素之一[2]。小胶质细胞在脑缺血后迅速激活[3]，在炎症反应引发迟发性神经元死亡中发挥重要作用。在小胶质细胞中，尼古丁通过α7- nAChR抑制LPS引发的TNF-α释放[4]。有报道谷氨酸可引发小胶质细胞释放炎性因子[5-6]。

本课题组前期研究发现尼古丁可抑制缺血脑区TNF-α、IL-1β的表达[7]，但不明确尼古丁是否抑制谷氨酸诱导的TNF-α、IL-1β的表达。因此，本研究旨在探索尼古丁在谷氨酸小胶质细胞炎性反应中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 尼古丁(Sigma)，L-谷氨酸(碧云天)，DMEM (GIBCO)，FBS(PAN BIOTECH)，PBS(武汉博士德生物有限公司)，胰酶(gibco)，MTT (Sigma)，DMSO(Sigma)，ELISA试剂盒(依科赛生物科技有限公司)。BV-2 小胶质细胞系(北京协和医科大学细胞中心)。超净工作台(ESCO),CO2 培养箱(Thermo Fisher)，离心机(Eppendorf 公司)，显微镜(Olympus 公司),水浴锅(上海比朗仪器)，涡旋混合器(上海亚荣生化仪器厂)，酸度计(赛多利斯科学仪器)，酶标仪(Molecular Devices)。

1.2 ELISA方法

实验分为6组，第1组为对照组，第2组为500μmol/L谷氨酸组，第3组为10μmol/L尼古丁组，第4组为500μmol/L谷氨酸+10μmol/L尼古丁组，第5组为500μmol/L谷氨酸+100μmol/L尼古丁组，第6组为500μmol/L谷氨酸+10μmol/L尼古丁+10nmol/L α-银环蛇毒素组。取生长状态良好的 BV-2 小胶质细胞，调整浓度15×104接种于6孔板中，每孔约 2mL，置 37℃，5% CO2 培养箱中培养12h 左右，待细胞贴壁后轻轻吸出上清，再加入不含血清的DMEM，饥饿处理，过夜，按预设的实验分组加药孵育24h。先加入α-银环蛇毒素，孵育30分钟，再加入不同浓度的尼古丁和500μmol/L谷氨酸[9-0]，孵育 24h 、48h后，取上清，按照TNF-α ELISA试剂盒和IL-1β ELISA试剂盒操作步骤测每组样本的OD值。通过OD值计算出TNF-α、IL-1β含量。每组设置3个复孔，取平均值，重复4次实验。

2.2 尼古丁抑制谷氨酸诱导的TNF-α增多，且与α7- nAChR有关 与500μmol/L谷氨酸组相比，加入10μmol/L尼古丁，孵育24小时后，TNF-α含量明显降低(P<0.01)(见图1)；加入100μmol/L尼古丁，孵育24小时后，TNF-α含量明显降低(P<0.05)(见图1)；10μmol/L与100μmol/L尼古丁组相比，无统计学意义(见图1)。而加入10μmol/L尼古丁，孵育48小时后，TNF-α含量明显降低(P<0.05)(见图2)；加入100μmol/L尼古丁，孵育48小时后，TNF-α含量明显降低(P<0.01)(见图2)；10μmol/L与100μmol/L尼古丁组相比，无统计学意义(见图2)。与500μmol/L谷氨酸+10μmol/L尼古丁组相比，加入10nmol/L α-银环蛇毒素，孵育24小时后，TNF-α含量增加(P<0.001)(见图1)。而加入10nmol/L α-银环蛇毒素，孵育48小时后，TNF-α含量又增加(P<0.05)(见图2)。

霍译 ：“Amitabha,Merciful Buddha!Bless His Holy Name!”said Mother Ma.

石警官的笑容更加明朗：“平素有友人来，总是随意地催促石某为他们吹一曲，甚至在酒楼大摆筵席，也要石某在酒味菜香中为他们助兴，当真是有辱斯文。石某历来难以从命，宁可让它闲置。”

2 结果

再多说一句，扩大内需重任当前，作为服务业，还需少些“傲娇”，多些实诚，尽快清理和消除那些霸王条款、歧视性规定甚至行业潜规则，以更大的诚意、更好的表现，打消人们的顾虑，让消费潜力更充分地释放。

1.3 统计学处理 实验结果统计处理均采用 SPSS17.0统计软件分析，作图采用GraphPad Prism 5.0，实验数据用表示，多组间比较先进行方差齐性检验，确定方差齐性(P>0.05)后，各组间比较采用 One way ANOVA 方差分析，多个样本均数间两两比较采用 LSD -t检验，如果方差不齐则用 Welch 和Games-Howell检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

  

图1 不同浓度尼古丁对谷氨酸诱导TNF-α的抑制作用

  

图2 不同浓度尼古丁对谷氨酸诱导TNF-α的抑制作用

2.3 谷氨酸可促进IL-1β增多 与对照组相比，加入500μmol/L 谷氨酸，孵育24小时后，IL-1β含量明显增加(P<0.01)(见图3)；孵育48小时后，IL-1β含量明显增加(P<0.05)(见图4)。

2.1 谷氨酸可促进TNF-α增多 与对照组相比，加入500μmol/L谷氨酸，孵育24小时后，TNF-α含量明显增多(P<0.05)(见图1)；孵育48h后，TNF-α含量明显增多(P<0.05)(见图2)。

2.4 尼古丁抑制谷氨酸诱导的IL-1β增多，且与α7- nAChR有关 与500μmol/L谷氨酸组相比，加入10μmol/L尼古丁，孵育24小时后，IL-1β含量明显降低(P<0.05)(见图3)；加入100μmol/L尼古丁，孵育24h后，IL-1β含量明显降低(P<0.05)(见图3)；10μmol/L与100μmol/L尼古丁组相比，无统计学意义(见图3)。而加入10μmol/L尼古丁，孵育48小时后，IL-1β含量明显降低(P<0.01)(见图4)；加入100μmol/L尼古丁，孵育48小时后，IL-1β含量明显降低(P<0.01)(见图4)；10μmol/L与100μmol/L尼古丁组相比，P<0.05(见图4)。与500μmol/L谷氨酸+10μmol/L尼古丁组相比，加入10nmol/L α-银环蛇毒素，孵育24h后，IL-1β含量增加(P<0.05)(见图3)。而加入10nmol/L α-银环蛇毒素，孵育48小时后，IL-1β含量又增加(P<0.05)(见图4)。

  

图3 不同浓度尼古丁对谷氨酸诱导IL-1β的抑制作用

  

图4 不同浓度尼古丁对谷氨酸诱导IL-1β的抑制作用

3 讨论

本实验研究的尼古丁可以明显抑制谷氨酸诱导的小胶质细胞释放炎性因子(TNF-α、IL-1β)，并且在一定范围内存在一定的量效关系，10μmol/L 时效果最显著。小胶质细胞是大脑中的主要免疫细胞[8]，当脑部受到缺血、缺氧等刺激后，小胶质细胞迅速激活[9]，释放一些细胞因子，清除病原体和细胞碎片，但过度激活的小胶质细胞会失去其正常的免疫功能，甚至转变为促炎作用，产生大量促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)以及其他炎性介质[10]。因此，抑制小胶质细胞过度炎症反应可能是脑缺血的有效治疗策略。谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质之一，同时又是一个很强的神经毒素[11,12]。生理情况下，谷氨酸绝大部分游离存在于细胞内，而细胞外的谷氨酸仅仅维持在1μmoL/L的低浓度，作为兴奋性神经递质参与信号传递。但当脑缺血发生时，谷氨酸的代谢平衡紊乱，细胞外谷氨酸含量急剧升高，谷氨酸受体被过度激活后产生一系列毒性反应。谷氨酸可诱导小胶质细胞发生形态学变化，呈活化、增殖状态，进而分泌 TNF-α、IL-1β、NO和 ATP。

为了探讨尼古丁在小胶质细胞炎性反应中的作用，本实验首先观察尼古丁是否抑制谷氨酸作用下的小胶质细胞释放炎性因子。研究表明10μmol/L尼古丁作用24、48小时后，小胶质细胞释放TNF-α减少；500μmol/L谷氨酸作用24、48小时后，小胶质细胞释放TNF-α、IL-1β增多；10、100μmol/L尼古丁作用24、48小时后，能使谷氨酸诱导的小胶质细胞释放TNF-α、IL-1β减少，10μmol/L尼古丁与100μmol/L尼古丁都可使TNF-α、IL-1β减少，但两者浓度差别无统计学差异，所以首选低浓度尼古丁；再加入10nmol/L α-银环蛇毒素后，TNF-α、IL-1β含量又增加。

综上所述，尼古丁可抑制谷氨酸诱导的小胶质细胞释放炎性因子，且与α7- nAChR密切相关。该实验能为脑缺血的治疗研究提供新思路，为临床新药治疗靶点的探究提供实验依据。

（三）坚持财政资金的绩效性。绩效，是现代财政制度的核心要义。花钱必有效，无效必问责，是财政管理的基本要求。要按照“全面实施绩效管理”的要求，把绩效理念深度融入预算管理全过程，切实做好预算编制、执行、使用、监管各环节的工作。在编制上：按照“保重点、控一般、促统筹、提绩效”的要求，科学编制预算，做到全面性、精准性、科学性。在执行上：强化预算刚性、原则性、严肃性，严控预算追加，杜绝粗放性。在使用上：按制度，依规矩，遵程序，把握均衡性、规范性，避免随意性。在监管上：严抓严管，常抓常管，敢抓敢管，建立覆盖全过程无缝隙监管制度，避免真空，防止死角。

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