糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的慢性并发症，是糖尿病患者死亡的主要原因。转换生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGF -β1 )被认为是导致DN发生的核心细胞因子， TGF-β1/smad信号通路是调控DN发生发展的重要信号途径[1]，Smad3是TGF-β1最重要的下游分子之一[2]。研究表明，替普瑞酮(geranylgeranylacetone, GGA)可诱导梗阻性肾纤维化大鼠模型中肾组织热休克蛋白72(heat shock protein 72, HSP72)高表达，抑制大鼠肾脏Smad3的活化，减少纤维连接蛋白(fibronectin, FN)的表达、改善肾组织纤维化[3]。DN的病理改变主要为细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)的异常沉积，FN为ECM的主要蛋白之一[4]，本研究中，我们构建DN大鼠模型，GGA灌胃诱导HSP72表达，以观察DN模型中，Smad3和FN表达的改变。

(6)当电路同时发生d1点、d3点故障短路时，由于两故障点均在正极，与d1点或d3点发生单点故障一致，在负荷1至负荷4的两端，仍然为220V电压，各负荷供电电压正常，由于电路接通，所以，电路不受影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 8周龄健康清洁级雄性SD大鼠36只，体重180～220g(购自江苏大学实验动物中心，动物合格证号:SYXK(苏)2008-0024)，血糖正常。试验期间，室温控制在16～18℃，湿度48% 12h交替照明，大鼠自由饮水、进食、保持垫料干燥。

1.2 试剂、药品和实验仪器 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，美国Sigma公司产品，批号S0130；替普瑞酮胶囊，卫材(中国)药业公司生产，规格50mg；兔抗鼠HSP72单克隆抗体，CST公司，货号4872S；兔抗鼠Smad3单克隆抗体，abcam公司，货号：ab40854；兔抗鼠FN多克隆抗体，abcam公司，货号：ab2413. Envision免疫组化试剂盒，购于武汉博士德公司；医用血糖仪，美国强生公司；尿蛋白定量试剂盒(夸马斯亮蓝法)购于南京建成生物工程研究所。

1.3 大鼠的分组、造模和干预 大鼠适应性喂养1周，随机分为对照组(NC组)，DN模型组(DN组)和GGA干预组(D+G组)，每组12只，NC组正常喂养，DN组和D+G组大鼠以45mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉，背部切开皮肤，逐步暴露左肾，剥离肾周薄膜，组织钳阻断肾门动静脉束，立即切除左肾，手术线结扎后逐层缝合伤口。术后第1天晚上禁食、不禁水。术后2周，按照35mg/kg腹腔注射STZ溶液，注射后，立即给予10%蔗糖水饮用，第2天改为普通饮水。72h后，尾静脉采血测血糖>16.7mmoL/L为糖尿病建模成功。2周后，尾静脉采血，医用血糖仪测血糖；代谢笼收集24h尿，夸马斯亮蓝法测定尿蛋白浓度，尿蛋白>30mg/24h为DN建模成功。D+G组以每日400mg/kg剂量GGA+溶媒(0.05%阿拉伯树胶+0.008%维生素E)灌胃，NC组和DN组以等体积溶媒灌胃，时间12周。研究过程中，DN组大鼠死亡2只，D+G组大鼠死亡2只，NC组未有大鼠死亡。

1.4 常规HE染色和PAS染色 12周末处死大鼠，去除右肾包膜后沿矢状线正中切开，取1/2肾脏用10%甲醛溶液固定、包埋、切片，行常规HE染色。PAS染色方法为：常规脱蜡至水，入1%过碘酸氧化10min，水洗，入schiff氏液染20min，水洗，苏木素染核，1%盐酸乙醇分化，氨水返蓝，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

1.5 免疫组织化学染色 按照试剂盒推荐的方法检测肾组织HSP72, Smad和FN的表达，基本步骤如下：将大鼠肾石蜡包埋组织切片4μm，脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性；HSP72采用EDTA缓冲液微波修复，Smad3、FN采用柠檬酸缓冲液微波修复，10%正常山羊血清封闭，加一抗覆盖组织，稀释比分别为：HSP72 1:100，Smad3 1:400，FN1:200，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜，PBS浸洗后滴加Envision通用型二抗，37℃孵育30min，DAB显色，水洗后苏木素复染，封片。

镇长再次见到牛皮糖，是一个月以后，在镇上的卫生院门口。牛皮糖端着一碗汤米粉蹲在院门口的桂花树下稀溜溜的喝，鼻涕流下来都顾不上擦。牛皮爹吃早餐？镇长主动的先打招呼。

2.1 大鼠一般状况的观察 NC组：大鼠体重增加明显，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。DN组：精神逐渐萎靡、明显消瘦、多尿、多饮、早期多动，后期反应迟钝、动作迟慢、弓背蛇体、多汗、毛竖无光泽、小便量多，每天需换垫料，尾部有出血、糜烂。D+G组：精神状况较模型组良好，动作自如，反应灵敏度较正常组稍差，无尾部出血和糜烂。

2.2 大鼠血糖和24小时尿蛋白定量的结果 腹腔注射STZ72小时后，血糖均>16.7mmol/L，未有死亡大鼠，2周后，DN组和D+G组(GGA灌胃前)2组各有2只大鼠死亡，存活的每只大鼠24小时尿蛋白定量均>30mg/24h，提示DN造模成功，3组大鼠的血糖和24h尿蛋白定量见表1。

第一，产品丰富，发展迅速。张家界市共有正式营业的演艺剧场6个，包括剧院类旅游演艺产品、实景类旅游演艺产品与景区综艺类旅游演艺产品。旅游演艺产品丰富，为游客提供观看的选择。张家界将演艺业与旅游业深度结合，旅游演艺在多年的发展中，上座率逐渐稳定，观看人数与日俱增，以《魅力湘西》与《天门狐仙》为代表的旅游演艺产品品牌吸引众多游客。

2 结果

1.6 免疫组化结果的判读 棕黄色颗粒为阳性信号。免疫组化染色后半定量分析采用Imag proplus5.0图像分析系统进行光密度分析，每只大鼠肾组织在400×光镜下随机随机选取3个视野，以平均光密度(OD)值作为HSP72，Smad3和FN的表达值。

外加剂对混凝土收缩与开裂性能影响的试验研究……………………………………………… 许荣水，程龙（2-247）

1.7 统计学处理 采用采用SPSS17.0软件进行数据统计，计量资料以标准差描述，组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

 

表1 3组大鼠血糖和24小时尿蛋白检测结果

  

NC组DN组D+G组血糖(mmol/L)4.90±0.6822.75±2.58∗24.10±3.01∗24小时尿蛋白(mg/24h)5.44±1.0993.46±30.30∗89.7±21.03∗

注：*表示与NC组比较，P<0.05

2.3 3组大鼠肾组织HE染色及PAS染色比较 NC组大鼠，肾小球基底膜正常，ECM未见明显增生。DN组，可见肾小球内毛细血管基底膜增厚，ECM明显增多，部分肾小球见具有诊断意义的K-W结节形成。D+G组肾小球基底膜增厚、ECM沉积较模型组降低，但较NC组明显，未见结节性硬化。PAS染色显示，NC组基底膜、ECM正常，DN组ECM显著增多，D+G组ECM较DN组减少。见图1。

2.4 HSP72, Smad3和FN免疫组化染色比较 NC组和DN组大鼠肾组织中，未检出HSP72的表达，D+G组大鼠肾小球系膜细胞及ECM中均可见HSP72的阳性表达。NC组中，未检出Smad3的表达或仅见微弱表达，在DN组中，可见Smad3广泛表达于肾小管细胞胞质内，肾小球内内微弱表达，D+G组中，Smad3表达较模型组减弱，OD值差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2，表2。对于FN，NC组中肾小球基底膜、肾小管基底膜中可见微弱表达，DN组肾小球基底膜、ECM和肾小管间质中广泛表达，而D+G组中，FN表达的范围和强度均较模型组减弱，OD值差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3，表2。

  

图1 3组大鼠肾组织HE和PAS染色(×400)

  

图2 3组大鼠肾组织HSP72和Smad3免疫组化染色(×400)

  

图3 3组大鼠肾组织FN免疫组化染色(×400)

 

表2 3组大鼠肾组织免疫组化OD值比较

  

NC组DN组D+G组HSP720.017±0.0040.021±0.0030.211±0.008∗#Smad30.039±0.0020.372±0.016∗0.198±0.005∗#FN0.027±0.0030.472±0.014∗0.287±0.021∗#

注：*表示与NC组比较，P<0.05，#表示与DN组比较，P<0.05

3 讨论

GGA是临床常用的抗胃溃疡药物，近年也发现其是一种无明显不良反应的HSP诱导剂，其结构中的类维生素A骨架能够诱导多种组织器官，如胃黏膜、心脏、肝脏、肾脏中HSP72的表达。HSP72为HSP70的诱导型[5]，在急性低氧环境下表达增加，是机体的保护性应激反应[6-7]。除了急性、亚急性应激反应外，HSP72的结构、表达水平、定位和功能异常与人类衰老、神经系统退行性病变、肿瘤和肾脏病等各种疾病相关。研究表明，人HSP72的基因多态性与糖尿病患者肾并发症的发生有关[8]，尿HSP72可作为2型糖尿病患者肾损伤早期的标记物之一[9]，提示HSP72可能影响DN的发生发展。DN的典型病理改变是肾小球肥大和ECM的过度沉积[10]，ECM是多种成分形成的高度有序的网络状结构,与肾脏纤维化的发生、发展方面密切相关，其主要成分是FN、层粘连蛋白 、胶原蛋白等，这些蛋白成分的增加可导致系膜基质增多、系膜区扩张, 最后导致了弥漫性肾小球硬化和间质纤维化。

本研究发现，按照文献报道的方法[11]，GGA灌胃能够成功诱导DN大鼠肾HSP72的表达，并可抑制DN大鼠肾组织Smad3和FN的表达，从而能够减轻肾组织纤维化，对DN的发生、发展具有保护作用。本研究尚存在一定的不足，如未检测GGA干预后大鼠的关键临床指标如血清肌酐，24小时尿蛋白水平等。HSP72抑制DN大鼠肾纤维化的机制为抑制TGF-β1诱导的Smad3的活化，减少FN的合成，是否有其他机制参与有待于体外实验的进一步研究。

参考文献

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[2] 肖争，尤燕华，李瑛，等.去甲斑蝥素抑制蛋白磷酸酶2Ac对Smad3-L区去磷酸化抗肾间质纤维化[J].中华肾脏病杂志，2015, 31(05): 359-366.

[3] MAO H, LI Z, ZHOU Y, et al.HSP72 attenuates renal tubular cell apoptosis and interstitial fibrosis in obstructive nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,1: F202-F214.

[4] 孟凡辰，郭兆安，于春江，等. 芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织血管内皮细胞生长因子及细胞外基质的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2014, 15(08): 676-681.

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[8] BURACZYNSKA M, SWATOWSKI A, BURACZYNSKA K, et al.Heat-shock protein gene polymorphisms and the risk of nephropathy in patients with type 2 diabetes[J]. Clin Sci, 2009, 116(1-2):81-86.

[9] 马永能，彭秀娟，杨自力，等.新型肾损伤标志物联合检测在2 型糖尿病肾损伤早期诊断中的价值[J].重庆医学，2015，44(27): 3791-3793.

[10] ASHCROFT F M，RORSMAN P. Diabetes mellitus and the βcell: the last ten years[J]. Cell, 2012, 148(06):1160-1171.

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