由于免疫抑制(如器官和造血干细胞移植)患者数目的持续上升，导致侵袭性真菌感染的发病率和死亡率增加[1]。在侵袭性真菌感染的情况下，真菌的快速、准确鉴定对临床治疗至关重要。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种新型微生物鉴定技术，具有准确、快速、方便、成本低、高通量的优点[2]，其鉴定微生物的范围极广，包括细菌、酵母菌、丝状真菌、分枝杆菌等[3]，此外还能对阳性血培养和尿培养标本进行直接鉴定[4-6]，在测试药物耐药性领域也有着广阔的应用前景[7]。从目前国内已发表的文献看，MALDI-TOF MS鉴定酵母菌的性能评价要少于细菌[8]，而VITEK 2 全自动细菌鉴定及药敏分析仪是很多实验室使用的鉴定酵母菌的自动化仪器，本研究从酵母菌鉴定时间、试剂成本、准确性3方面对MALDI-TOF MS(v2.0数据库)和VITEK 2进行评价，报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 共收集酵母菌144株，包括7个属和7个种。所有菌株来源于2015年6月至2016年12月广西医科大学第四附属医院住院及门诊患者送检标本，标本种类包括血液、尿液、分泌物、胸腹水、脑脊液等。菌株分离后，使用40%甘油肉汤保存在-80℃低温冰箱中。

1.2 仪器 VITEK MS型基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)仪、VITEK2全自动细菌鉴定及药敏分析仪、BacT/ALERT 3D血培养仪(法国生物梅里埃公司)，ABI 7500聚合酶链反应仪(美国Applied Biosystems公司)，Alphamager HP凝胶成像系统(美国Protein simple公司)。

1.3 试剂 中和抗生素儿童瓶、沙保弱培养基、VITEK 2 YST鉴定卡(上海生物梅里埃公司)；VITEK MS配套试剂(主要为基质液、甲酸、靶板，法国生物梅里埃公司)；PCR反应相关试剂(如引物、Tag酶，美国Thermo Scientific公司)。

1.4 质控菌株 大肠埃希菌ATCC8739由法国生物梅里埃公司提供、近平滑假丝酵母菌ATCC22019、白色假丝酵母菌ATCC14053由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

1.7 成本和时间计算 成本计算方法：主要计算VITEK 2和VITEK MS消耗的试剂成本(除外人工和仪器维护费用)。VITEK 2 试剂包括YST卡、0.45%无菌盐水、一次性试管、一次性无菌拭子、一次性tip头。VITEK MS试剂包括靶板、基质液、甲酸、1μL定量接种环、一次性tip头。时间计算方法：操作人员在使用VITEK 2 和VITEK MS鉴定酵母菌时，分别记录每株菌的上机操作时间(即酵母菌分析前处理时间)和鉴定时间(即自动分析程序获取酵母菌鉴定结果的时间)。

将方法 1.3.1所提取到的花桥板栗淀粉配置成质量分数为10%的淀粉悬浊液，置于90 ℃热水中加热糊化30 min后，分别移装于平皿（90×15 mm）中并在室温条件下冷却，即得相态转变次数0次的淀粉凝胶样品。再将剩余淀粉凝胶依次移装密封置于-18 ℃的冰箱中进行冷冻处理，冷冻 22 h之后，将其放入30 ℃温水中进行融化，融化时间为2 h。至此获得水分子相态转变1次后的花桥板栗淀粉凝胶。按此方法依次制备相态转变次数为1、2、3、4、5、6、7次的淀粉凝胶样品，备用。

1.5 酵母菌鉴定 将保存在-80℃低温冰箱中的144株酵母菌取出，解冻后使用沙保弱培养基传代2次：需氧环境35°C孵育24～48h，必要时延长培养72h保证适当的生长。使用VITEK MS 和VITEK2对酵母菌分别进行鉴定，操作方法参考仪器说明书。

1.6 序列扩增及分析 对VITEK 2和VITEK MS鉴定结果不一致时，进行16S rRNA测序，序列扩增方法参考文献报道进行[9]。测序结果在NCBI GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行Blast比对，比对结果按16S rRNA基因序列相似性大于99.0%的菌株归于同一物种[9]。

由此本研究认为，通过对高龄妊娠妇女进行胎儿大脑中动脉的监测对于临床预测不良妊娠结局具有一定的作用，而其独立预测价值则需进一步大样本量分析。

2 结果

一年级结束之后，二年级的语文教学就要求老师教学生查字典，在语文教材的“语文园地二”中，就提及部首查字法。这是教学生怎样使用工具书，算得上二年级上半学期的教学重点之一。在二年级下册的语文教材中，并没有提到查字典的另外一种方法——音序查字法。在这种情况下，老师就可以利用微课给学生展示音序查字法，让学生获得更多知识。

2.1 鉴定结果比较 144株酵母菌，包括7个属和7个种，VITEK MS将98.6%(142/144)鉴定到属水平，98.6%(142/144)鉴定到种水平。VITEK 2 将96.5%(139/144)鉴定到属水平，93.8%(135/144)鉴定到种水平。130(90.3%)株菌经2种方法鉴定，结果完全一致。两种方法鉴定不一致的菌株有14株，VITEK MS和VITEK 2鉴定错误率分别1.4%、6.3%。2种方法鉴定酵母菌到属水平的准确率，差异无统计学意义(P>0.05)，但是鉴定到种水平的准确率、鉴定错误率差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 时间和成本比较 在时间方面，VITEK MS鉴定酵母菌的上机操作时间(1.2±0.2)min，鉴定时间(1.3±0.1)min；VITEK 2 上机操作时间(3.5±0.3)min，鉴定时间(1098.3±13.1)min；在试剂成本方面，VITEK MS鉴定每株菌的试剂成本(12.5±0.2)元，VITEK 2 为(68.4±0.5)元。2种方法鉴定酵母菌的时间和试剂成本，差异有统计学意义(P<0.05)。

1.8 统计分析 计量资料用均数±标准差表示，VITEK 2 和VITEK MS鉴定酵母菌的时间和试剂成本比较采用配对t检验；2种方法鉴定酵母菌的准确率，采用卡方检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

 

表1 VITEK MS、VITEK 2 、16sRNA在鉴定144株酵母菌的结果比较

  

VITEK 2 (n) n=144VITEK MS (n) n=144VITEK MS与VITEK 2 一致率(%)16S rRNA (n) n=15白假丝酵母(29)白假丝酵母(29)100光滑假丝酵母(20)光滑假丝酵母(20)100热带假丝酵母(23)热带假丝酵母(23)100近平滑假丝酵母(16)近平滑假丝酵母(11)68.75罗伦特隐球菌(1)近平滑假丝酵母(1)C.orthopsilosis(1)C.orthopsilosis(1)Lodderomyces.elongisporus(2)Lodderomyces.elongisporus(2)无鉴定结果(1)C.orthopsilosis(1)都柏林假丝酵母(1)都柏林假丝酵母(1)100克柔假丝酵母(20)克柔假丝酵母(20) 100季也蒙假丝酵母菌(4)季也蒙假丝酵母菌 (3)75奥默柯达菌(1)奥默柯达菌(1)无名假丝酵母(1)热带假丝酵母(1)0热带假丝酵母(1)葡萄牙假丝酵母(3)葡萄牙假丝酵母(3)100皱落假丝酵母(1)皱落假丝酵母(1)100希木龙假丝酵母(1)希木龙假丝酵母(1)100热带/近平滑假丝酵母(2)热带假丝酵母(1)0热带假丝酵母(1)奥默柯达菌(1)热带假丝酵母(1)近平滑/无名假丝酵母(1)近平滑假丝酵母(1)0近平滑假丝酵母(1)新型隐球菌(5)新型隐球菌(4)80无鉴定结果(1)新型隐球菌(1)阿沙丝孢酵母菌(5)阿沙丝孢酵母菌(5)100奥默柯达菌(4)奥默柯达菌(4)100酿酒酵母菌 (4)酿酒酵母菌(4)100西弗射盾子囊霉(4)西弗射盾子囊霉菌(1)25无鉴定结果(3)西弗射盾子囊霉菌(3)

3 讨论

过去的几十年中，临床微生物学实验室鉴定酵母菌的方法有了明显改善，从简单的手工生化到自动化生化方法，到以先进的核酸为基础的检测[10]。虽然这些先进的方法大大提高鉴定真菌的能力，然而这些方法的局限性包括成本，鉴定时间，某些情况下需要相当的专业知识。此外，一些罕见真菌的鉴定结果并不理想[11]。MALDI-TOF MS是一种新型微生物鉴定技术，在鉴定酵母菌上具有准确、快速、方便、成本低、高通量的优点[2]，弥补传统生化鉴定和分子生物学技术的不足。本研究从酵母菌鉴定时间、试剂成本、准确性3方面对VITEK MS(v2.0数据库)和VITEK 2进行评价，研究发现：VITEK MS在酵母菌鉴定上具有试剂成本低和鉴定时间短的显著优势。VITEK 2 鉴定酵母菌的试剂成本约为VITEK MS的 5.5倍，上机操作和鉴定时间合计约为VITEK MS的440倍，这与Tan KE等报道相近[12]。虽然VITEK MS在试剂成本上占有优势，但是实验室仍需要考虑仪器成本和维修成本，VITEK MS仪器成本昂贵，限制了其在临床微生物实验室的使用，但是，实验室一旦收回仪器成本，消耗的试剂成本是非常低的。

在鉴定酵母菌的准确性上，VITEK MS和VITEK 2 鉴定酵母菌到属水平的准确性相当，但在种水平的准确性VITEK MS优于VITEK2(P<0.05)，鉴定错误率VITEK MS低于VITEK 2(P<0.05)，这与之前报道的结果一致[13]，例如Iriart X等报道的VITEK MS鉴定酵母菌的准确率优于VITEK2(P<0.01)，鉴定错误率低于VITEK2(P<0.05)[13]。Iriart X等学者的研究和我们的研究在种水平准确性差异较大的最可能是因为选择菌种的不同。Iriart X的研究包括了乳酒假丝酵母、平常假丝酵母、挪威假丝酵母、Candida nivariensis、Candida palmioleophila、白地霉和头地霉这些鉴定难度大的酵母菌，但并没有包括在我们的研究中。在鉴定上，最令人不安的是酵母菌鉴定错误，特别是错误的鉴定有可能影响到患者的治疗时。显然，酵母菌鉴定到种水平是非常重要的，因为一些酵母菌表现出固有耐药性，如葡萄牙假丝酵母菌对两性霉素B天然耐药[14]，克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，光滑假丝酵母对氟康唑和伊曲康唑存在固有的敏感性低的现象[15]，因此鉴定错误可能导致死亡率和发病率的增加。本研究分离到酵母菌多为以下5种：白假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母、近平滑假丝酵母，这些酵母菌具有明显的敏感性[14]。因此，采用VITEK MS快速鉴定上述酵母样菌，能帮助医生经验使用抗真菌药物，从而将提高病人护理和大幅减少医院相关费用。尽管VITEK MS的性能令人满意，但我们的研究也存在一些局限性：第一，所有酵母菌均在沙保弱培养基上生长，并使用VITEK MS检测，因此对其他类型培养基上生长的酵母菌采用VITEK MS检测的性能是未知的。第二，这项研究中检测的144株酵母菌，都包含在VITEK MS v2.0数据库中，如果使用这个系统检测一些不常见的酵母菌可能会出现鉴定错误或者不能鉴定的情况。当然，VITEK MS RUO系统，可将罕见酵母菌的质谱添加到数据库，从而提高不常见的酵母菌的鉴定率，而VITEK MS IVD系统不允许用户将质谱添加到数据库中，这只能依靠数据库不断升级来解决[3]。

综上所述，这项研究对VITEK MS鉴定临床常见酵母菌的准确性、时间、试剂成本进行评价，并和VITEK 2进行比较。2种方法鉴定酵母菌到属水平的准确性相当，但VITEK MS比VITEK 2更快速、试剂成本更低、种水平的准确性更高、错误鉴定率更低，VITEK MS鉴定临床常见酵母菌的性能优于VITEK2，该技术有可能在鉴定临床常见酵母菌上取代传统的生化鉴定方法。VITEK MS在临床微生物实验室的应用，对缩短酵母菌报告周期，积极影响患者治疗，降低医疗费用有重要作用。

新奇士柠檬醋：本实验室研制并保存；氢氧化钠、盐酸、抗坏血酸、溴代萘、无水乙醇、酚酞：购自北京化工厂；丙酮：购自安徽合肥科技有限公司。

参考文献

[1] WESTBLADE L F, JENNEMANN R, BRANDA J A, et al． Multi-Center Study Evaluating the VITEK MS for Identification of Medically Important Yeasts [J]．J Clin Microbiol，2013，51(07)：2267-2272.

[2] 姜长宏，龙军，华夏．基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪在侵袭性真菌感染病原真菌鉴定中的应用[J].实用医学杂志，2015，31(17)：2902-2904.

[3] WATTAL C，OBEROI JK，GOEL N，et al．Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for rapid identification of micro-organisms in the routine clinical microbiology laboratory[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2017，36(05)：807-812.

[4] GAUTIER M, RANQUE S, NoRMAND A C,et al．Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry: revolutionizing clinical laboratory diagnosis of mould infections[J]. Clin Microbiol Infect ，2014，20(12)：1366-1371.

[5] MATHER C A,RIVERA S F,BUTLER-W S. Comparison of the Bruker Biotyper and Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-timeof flight mass spectrometry systems for identification of mycobacteria using simplified protein extraction protocols[J].J Clin Microbiol，2014，52(01)：130-138.

[6] RODRIGUEZ S B,SANCHEZ C C,RUIZ A, et al. Direct identification of pathogens from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Clin Microbiol Infect，2014，20(07)：421-427.

[7] BURCKHARDT I, ZIMMERMANN S.Using matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry to detectcarbapenem resistance within1 to 2.5 hours[J].J Clin Microbiol，2011，49(9)：3321-3324.

[8] 张博筠，叶乃芳，王中新.MALDI-TOF MS鉴定酵母菌应用评价[J].安徽医科大学学报，2017，52(04)：501-504.

[9] GUO L,YE L,ZHAO Q,et al.Comparative study of MALDI-TOF MS and VITEK 2 in bacteria identification[J].J Thorac Dis ，2014，6(05)：534-538.

[10] MARCOS J Y,PINCUS D H. Fungal diagnostics: review of commercially available methods[J].Methods Mol Biol，2013，968：25-54.

[11] SANGUINETTI M,PORTA R,SALI M,et al.Evaluation of VITEK 2 and RapID yeast plus systems for yeast species identification: experience at a large clinical microbiology laboratory[J],2007，J Clin Microbiol，45(04)：1343-1346.

[12] TAN KE,Ellis BC, LEE R,et al.Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness[J].J Clin Microbiol，2012,50(10)：3301-3308.

[13] IRIART X,LAVERGNE RA,FILLAUX J,et al.Routine identification of medical fungi by the new Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight system with a new time-effective strategy[J].J Clin Microbiol，2012,50(06):2107-2110.

[14] PAPPAS PG, KAUFFMAN CA, ANDES D,et al.Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis，2009,48(05)：503-535.

[15] SOW D, FALL B,NDIAYE M,et al. Usefulness of MALDI-TOF Mass Spectrometry for Routine Identification of Candida Species in a Resource-Poor Setting [J].Mycopathologia，2015，180(3-4)：173-179.