大量的转录组测序和基因芯片结果表明，在肿瘤组织中有广泛的非编码RNA改变。前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是男性生殖系统常见的恶性肿瘤，其发病率居全球男性肿瘤的第一位，死亡率占男性肿瘤死亡率的第三位。其发病有明显的地区差异，我国发病率远低于欧美国家，但随着生活方式的改变，发病率呈增高趋势。非编码RNA是一类不能或很少编码蛋白质的RNA分子，以往的肿瘤研究一直集中在编码RNA方面，近几年的研究表明，曾经被认为是“转录垃圾”的非编码RNA在基因表达的各个层面起着至关重要的作用。本研究以前列腺癌细胞为研究对象，采用分子生物学技术，探讨lncRNA-MALAT1对前列腺癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人前列腺癌细胞株22RV1、PC3(中科院上海细胞研究所细胞库)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，Amresco,美国)；RPMI1640培养基及胎牛血清(Gibco,美国)；Trizol、PrimeScript RT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ ( TaKaRa,大连，中国)；引物(生工，上海，中国；GAPDH-forward, 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′GAPDH-reverse,GAPDH-reverse,5′-CAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′；MALAT1-forward, 5′-CTTCCCTAGGGGATTTCAGG-3′ MALAT1-reverse, 5′-GCCCACAGGAACAAGTCCTA-3′)； siRNA(吉玛，苏州，中国； MALAT1-sense, 5′-GCUGUGGAGUUCUUAAAUATT-3′; MALAT1-antisense, 5′-UAUUUAAGAACUCCACAGCTT-3′; Negative-sense: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3′; Negative-antisense, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)；LipofectamineTM 2000(Invitrogen，荷兰)；PBS、双(Gibco,加拿大)；

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：22RV1、PC3细胞培养于添加10%胎牛血清、100μg/mL 链霉素和100U/mL青霉素的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。每日观察细胞生长情况，约2d～3d换液，5d～7d细胞密度达80%时传代，取生长状态良好的对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 转染 为了探讨MALAT1与前列腺的关系，我们构建了下调MALAT1 的小干扰RNA(MALAT1-siRNA) 和作为空白对照的乱序的siRNA 载体(Negative-siRNA)。转染前1日，将适当密度处于对数生长期的细胞接种于60 mm培养皿中，使其在转染时丰度达60%～80%。转染当日，用500μLOPTI-MEM培养基稀释适量的质粒，室温放置5min；同时用500μLOPTI-MEM培养基稀释LipofectamineTM 2000转染试剂，混匀，室温放置5min；将稀释好的质粒与LipofectamineTM2000转染试剂混合，室温放置20min，得到转染复合物。在转染复合物形成的同时，用新鲜培养基将细胞冲洗一次，并加入3000μL的不含血清培养基。转染复合物直接加入培养皿中，轻轻摇匀，置于细胞培养箱培养。得到转染MALAT1-RNAi载体的细胞株22RV1/PC3-siMALAT1及转染无关干扰序列的22RV1/PC3-Contro。

1.2.3 RNA提取 用3.5cm培养皿培养对数生长期细胞密度达到70%～80%，弃去培养液，PBS溶液洗两次，吸净残余PBS溶液，加入1mLTRIZOL，室温放置10min，充分吹打均匀，移到1.5mL Ep管中。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。12,000×g，4℃离心15 min。仔细吸取上层水相，移至另一新的1.5 mL Ep管中，按每l mL TRIZOL加0.5 mL的比例加入异丙醇，振荡混匀，室温静置10min，12,000×g，4℃离心10min，收集沉淀。lmL预冷的用DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀，7,500×g，4 ℃离心5 min。小心去掉上清，超净台放置5～10 min，自然干燥RNA沉淀，加入适量的DEPC水溶解RNA，-80℃保存备用。

cDNA

Total：

Forward Primer(10 μM)

坚持和发展中国特色社会主义，必须由马克思主义政党来领导。马克思主义理想信念和价值追求是中国特色社会主义形成发展的逻辑起点。习近平总书记指出：“中国特色社会主义理论体系归根到底是以马克思主义基本理论为指导的，是把这些基本理论同中国具体实际相结合的结果。”[注]习近平：《在全国党校工作会议上的讲话》，第15页。没有中国共产党领导，就没有中国特色社会主义道路、理论、制度、文化。不坚持中国共产党领导，已有的成果也会丢失。世界历史上正反两方面的事实都证明，只有坚持党的领导，才能保证社会主义不变色、不变质，才能让社会主义蓬勃发展。

SYBR® Premix Ex TaqTM (2×)

12.5 μL

心境障碍，又称情感障碍，是指由各种原因引起的、以显著而持久的心境或情感改变及认知功能损害为主要特征的一组精神障碍[1]。它主要包括抑郁症、双相障碍、心境恶劣及环性心境障碍等。世界卫生组织的调查显示心境障碍的患病率呈现快速上升趋势，目前全球约有0.44亿双相障碍患者、3.5亿抑郁症(单相抑郁)患者[2]。如此庞大的患者群体，加上高发病、高复发、高致残的特点，给家庭和社会增加了沉重的经济负担和巨大的精神压力。执行功能损害是双相障碍和抑郁症患者生活质量下降、心理社会功能受损的重要因素，严重影响疾病预后和社会功能康复。

0.5 μL

Reverse Primer(10 μM)

0.5 μL

1.2.4 RNA的浓度及纯度鉴定 取RNA样品2μL，加去离子水稀释50倍，加入比色杯中，紫外线分光光度计测定OD260值和OD280值。根据OD260/OD280比值判断RNA样品的纯度。高纯度RNA的OD260/OD280为1.80～2.00。根据1OD=40μg/mL，计算RNA的浓度。

2.0 μL

ddH2O

1.2.6 聚合酶链反应 本研究实时定量PCR实验采用ABI 7500定量PCR仪。获得数据处理采用基因表达相对定量方法，相对内参照GAPDH基因表达，采用delta CT方法来计算。PCR反应体系：反应液配制在冰上避光进行。

9.5 μL

1.2.5 逆转录 13.5L反应体系中含有2g总RNA作为模板、1L Oligo dT引物、1LdNTPs并用去离子水补足到13.5 L，于65 °C反应5min，立即置于冰上。加入4L 5×First strand buffer及2L 0.1 MDTT，于42℃反应2 min。加入0.5LSuperscriptⅡ逆转录酶，混匀。于42℃作用50min，并于70℃作用15min。cDNA样品-20 ℃保存备用。

25 μL

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45s；55℃复性45s；72℃延伸30s；循环45次，延伸7 min。所有反应重复三次，2 -△△Ct定量。

当前，跨语言查询扩展研究主要针对大语种以及欧洲国家语言等等，而针对东盟语言的报道不多.鉴于此，本文以东盟语言为研究对象，提出基于完全加权正负关联模式挖掘的越-英跨语言查询译后扩展算法.该算法采用新的完全加权正负项集支持度和关联度计算方法以及模式评价框架，对跨语言初检用户相关反馈文档集挖掘译后查询扩展词.与单语言、跨语言检索基准和现有基于伪相关反馈、加权关联模式挖掘的跨语言查询扩展算法比较，本文算法能有效地减少跨语言信息检索中查询主题漂移和词不匹配问题，提高和改善跨语言检索性能.本文模式挖掘方法在推荐系统具有一定的应用价值，能提高其准确性.

普陀区桃浦镇北环水系位于上海市的西北部，包括横塘河、三面浜、三面浜支河、月湾浜、月湾浜支河、南北厅湖，随着工业化时代的到来，大量工业废水和生活污水的未经处理排放导致桃浦镇北环水系的水体生态环境也受到了巨大影响。因此，有必要加强对水系水体的生物生态修复和治理，才能为我国水资源保护工作的开展产生积极影响。

1.2.7 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期22RV1、PC3细胞，调节活细胞密度为1×105个细胞/mL细胞悬液，接种于96孔板中，设转染MALAT1 siRNA的实验组及转染Negative siRNA的对照组，每组设6个平行孔，分别培养12h后，各组每孔加入MTT 溶液(0.5mg/mL) 20μL，继续培养4h，弃上清，每孔加入DMSO 150μL，振荡10min。酶标仪于490nm波长处测定A值。

1.3 统计学方法 采用Graphpad prism5.1 for windows进行描述性统计。计量资料用“”表示，组间两两比较采用t检验。P<0.05差异有统计学意义。

在韩国，大多学校都采用的是自主探究与小组讨论的方式进行教学。上课时，教师尽量发挥学生的主观能动性，让他们参与到教与学的过程中来。教师除了进行一般的课程讲解之外，还将班级学生分成几个小组，并把课程按章节或者课题作为任务分配给每个小组，每个小组负责将章节或课题的知识内容理解透彻，并给其他学生讲解该章节或课题，在此过程中，学生们通过备课和授课得到了很好的锻炼。

2 结果

2.1 转染MALAT1-siRNA对MALAT1 表达的影响 realtimePCR检测后发现在22RV1和PC3细胞中转染MALAT1-siRNA组比转染无关干扰序列的对照组，MALAT1的表达水平显著下调(P<0.01)，即下调MALAT1 表达的22RV1和PC3细胞株构建成功(图1、图2)。

  

图1 realtimePCR法检测MALAT1

注：*在22RV1细胞中的敲减效率,P<0.01

  

图2 realtimePCR法检测MALAT1

注：*在PC3细胞中的敲减效率P<0.01

2.2 下调MALAT1 对前列腺癌细胞22RV1/PC3增殖能力的影响 MTT实验显示干扰MALAT1 的表达后，22RV1和PC3增殖能力显著下降(图3、图4)。说明LncRNA- MALAT1可能参与了前列腺癌细胞的增殖。

管理说到底就是管和理，由于人与事密不可分，人都要有事做，事都要人去做，管与理也就相提并论、互相影响，但在学校的实际工作中管和理的侧重点是有所不同的。

  

图3 MTT法检测22RV1细胞的增殖能力

注：*P<0.05

  

图4 MTT法检测PC3细胞的增殖能力

注：*P<0.05

3 讨论

前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性疾病，发病率随年龄而增长，其发病有明显的地区差异，欧美地区较高，发病率仅次于肺癌，占男性癌症死亡原因的第二位。我国发病率较低，但由于人口老龄化及生活水平的提高，前列腺癌的发病率逐年增加，其危害也愈发严重，远处转移是前列腺癌患者死亡的主要原因。

长链非编码RNA(long non-coding RNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，哺乳动物基因组序列中4%～9%的序列产生的转录本是lncRNA，而相应的蛋白编码RNA的比例只有1%。lncRNA并不编码蛋白或者只是编码很短的多肽，起初他们被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明lncRNA参与基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录后调控、蛋白功能调节等多种重要生理活动，逐渐引起人们的广泛关注。有研究表明，在前列腺癌的发生过程中有许多lncRNA发生了特征性的改变，并参与关键性信号转导通路的调节[1]。有研究者发现在前列腺癌患者的尿液中lncRNA-p21含量与前列腺良性增生的患者存在显著性差异，并认为可以作为前列腺癌诊断的临床标志之一[2]。Li L等发现在接受去势治疗的前列腺癌患者中肥大细胞能够通过减弱lncRNA-HOTAIR与PRC2形成复合体的过程，而减少与AR启动子区的结合，从而降低AR的表达促进前列腺癌细胞的侵袭和转移[3]。还有研究者证实lncRNA-GAS5能够恢复CRPC患者的雄激素受体敏感性，促进前列腺癌细胞的凋亡，而通过抑制mTORC可以增加lncRNA-GAS5的表达[4]。近来还有人发现lncRNA-HOXD-AS1能够通过富集WDR5调控具雄激素抗性的前列腺癌的增殖和化疗耐药[5]。因此进一步了解lncRNA在前列腺癌的发生、发展过程中所起的作用，可以为前列腺癌的诊断、治疗提供更多潜在的靶点。MALAT1编码基因定位于染色体11q13.1，转录本序列长约 8kb，属于基因间转录本，是在研究非小细胞肺癌的过程中发现的与其侵袭和转移密切相关的长链非编码RNA。研究发现MALAT1在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用。本研究证实，在采用siRNA 降低了lncRNA-MALAT1的表达后，减少了前列腺癌细胞的增殖，表明长链非编码RNA-MALAT1能够促进前列腺癌细胞的增殖，其具体机制还需进一步探讨。

参考文献

[1] 白成,崔荣军.泌尿系统肿瘤与lncRNAs[J].现代医药卫生,2016,32(12):1867-1869.

[2] ISIN M UYSALER E,OZGUR E,et al. Exosomal lncRNA-p21 levels may help to distinguish prostate cancer from benign disease[J]. Front Genet,2015,6:168.

[3] Li L, DANG Q, XIE H,et al.Infiltrating mast cells enhance prostate cancer invasion via altering LncRNA-HOTAIR/PRC2-androgen receptor (AR)-MMP9 signals and increased stem/progenitor cell population[J]. Oncotarget. 2015, 6(16):14179-14190.

[4] YACQUB U K, PICKARD M R, WILLIAMS G T. Reciprocal regulation of GAS5 lncRNA levels and mTOR inhibitor action in prostate cancer cells[J]. Prostate, 2015, 75(07):693-705.

[5] GU P, CHEN X, XIE R, et al. lncRNA HOXD-AS1 Regulates Proliferation and Chemo-Resistance of Castration-Resistant Prostate Cancer via Recruiting WDR5.[J].Molecular Therapy,2017,25(08):1959-1973.