先天性巨结肠(HD)又称为肠管无神经节细胞症，指结肠末端缺乏神经节细胞致肠管持续痉挛，粪便淤滞于近端结肠，近端结肠肥厚、扩张。此病是小儿常见的先天性肠道畸形，发病率高[1]，占先天性消化道畸形的第2位。确诊依据病理发现病变肠管无神经节细胞，因此辨认无神经节细胞至关重要，但是新生儿及小婴儿由于神经节细胞发育不成熟，常规HE染色不易观察。本实验研究钙视网膜蛋白(CR)在新生儿HD表达的特点，并同时对比观察神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、S-100蛋白(S-100)这两种神经标记物在新生儿HD表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集我院2006年1月-2014年6月HD患儿手术切除标本50例作为实验组，其中男37例，女13例，日龄18～31 d。患儿均有胎粪排出异常，腹胀。所有HD患儿诊断依据病史、体征、钡灌肠、直肠肛管测压检查结果综合判断，并经术后病理检查结果确诊。另选取10例新生儿因其他非肠神经节病变而行结肠手术的患儿结肠全层的病理标本作为对照组。

1.2 主要试剂与仪器：CR、S-100、NSE为即用型单克隆抗体和即用型快捷免疫组化PV9000试剂盒，均购自中杉金桥公司。脱水机ASP300S、包埋机EG1150C、切片机RM2245、全自动染色机ST5020和封片机CV5030均购自LEICA公司。

1.3 染色方法及结果判断：所有石蜡切片均取自病变狭窄段。

1.3.1 石蜡切片脱蜡水化：在65 ℃烤片4 h后二甲苯5 min×4次，100%无水乙醇5 min×2次，95%乙醇4 min×1次，85%乙醇4 min×2次，75%乙醇4 min×1次，自来水流水冲洗。

1.3.2 免疫组织化学染色：高压锅100 ℃修复3 min，自然冷却，PBS洗5 min×3次；3% H2O2室温孵育10 min，PBS洗2 min×3次；滴加一抗工作液，室温(25 ℃)孵育2～3 h，PBS洗2 min×3次；滴加反应增强剂，25 ℃孵育20 min，PBS 洗2 min×3次；滴加二抗，25 ℃ 30 min，PBS洗2 min×3次；DAB显色10 min，苏木精复染1 min，分化、返蓝；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3.3 结果判定:CR、NSE免疫组织化学染色，黏膜下神经丛中神经纤维棕黄色着色，判定为阳性，即排除HD;若未着色判定为阴性，即诊断HD。S-100免疫组织化学染色，黏膜下神经丛中神经纤维棕黄色着色，判定为阳性，即诊断HD；若未着色判定为阴性，即排除HD。

1.4 统计学方法：采用描述性统计方法，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫染色表达情况：镜下观察免疫组织化学染色，CR免疫染色，对照组全部阳性，即正常肠壁黏膜下层和肌间层神经丛神经节细胞内呈棕黄色，弥漫分布于细胞胞浆，结肠黏膜细胞及肠壁肌细胞不着色(图1，目录后)；实验组全部患儿呈阴性，显示没有神经节细胞的存在(图2，目录后)。NSE免疫染色，对照组全部阳性，即神经节细胞胞浆呈深棕色，神经丛中雪旺细胞和胶质细胞对NSE呈弱阳性反应，表现为淡黄色的神经丛中散在有深棕色的小团块(图3，目录后)；实验组43例患儿阴性，显示没有神经节细胞的存在；7例患儿弱阳性，显示神经元的减少。S-100免疫染色，对照组8例患儿阴性，显示黏膜下神经丛中没有雪旺细胞及周围胶质细胞，2例患儿阳性，即显示黏膜下神经丛中雪旺细胞及周围胶质细胞增生呈深棕色(见图4，目录后)；实验组47例患儿阳性，3例患儿阴性。

2.2 HD检出率：CR检出率为100%(50/50)，NSE检出率为86%(43/50)，S-100检出率为94%(47/50)，3种免疫染色比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

 

表1 3种免疫染色法HD检出率的比较

  

免疫染色n检出检出率(%)χ2值P值CR5050100．07．92<0．05NSE504386．0S-100504794．0

3 讨论

HD在临床上表现为患者完全或不完全性肠梗阻，严重影响着患儿的生活质量[2-3]。HD常自新生儿期起病，是引起新生儿低位肠梗阻的最常见原因，新生儿期肠梗阻20 %由 HD引起。HD对新生儿的生长发育有着很大的影响，经肛门HD根治术的推广，从根本上实现了新生儿期可以治疗，但由于新生儿期HD的术前诊断仍然困难，故不能得到及时治疗。多数新生儿患儿需要反复检查、诊断，直到生后1～3个月才能得到治疗。

由于新生儿期发病症状不典型，钡剂灌肠、肛门直肠测压等辅助检查有一定的局限性，病理检查是诊断 HD的金指标，但HE染色神经节细胞的形态不易与胶质细胞以及雪旺细胞鉴别，再加上炎症细胞的影响，造成神经节细胞不容易观察[4]。目前用于诊断 HD的免疫组织化学染色有RET、bcl-2、NSE、S-100、NGFR等[5-6]，这些方法使得 HD诊断变得容易些，但仍有一些标本诊断困难。本组NSE对新生儿HD肠壁检出率为86%，低于以往的检出率[7]，这正说明了NSE是HD的肠壁标记物，但在新生儿HD中检出率不高。本组S-100对新生儿HD肠壁检出率较高，为94%，但值得注意的是其在对照组中出现阳性情况，这提示单纯依靠S-100标记，存在假阳性可能。

1.2 调查方法 采用自行设计的广州市医疗机构工作人员医院感染控制相关知识调查问卷，通过横断面调查法，运用现场统一发放填写的方式进行调查。调查问卷内容包括：①个人情况：机构名称、机构级别、性别、年龄、文化程度等；②院感知识掌握情况：即了解医务人员对医院感染理论知识的掌握，包括传染病认知、院感传播知识认知、手卫生认知、治疗过程防护认知、消毒与灭菌认知、医院污物处理认知等调查；③操作相关知识：了解医务人员医疗操作过程中的院感防控意识。

目前，农村配电网发生的故障主要有两类：永久性故障和瞬时性故障。其中瞬时性故障约占故障总数的80%以上。当线路发生瞬时故障时，断路器通过过流保护会跳闸，线路处于停电状态，如果线路未装设重合闸装置，线路不再送电，大大影响了供电可靠性。因此重合闸对配电网的持续供电和稳定运行起到重要的作用。

CR是神经细胞内重要的活性物质，对细胞质内Ca2+浓度具有缓冲作用，Ca2+是细胞内重要的第二信使，它参与一系列神经细胞生理活动，对神经细胞的代谢和功能产生广泛的影响。研究发现与钙结合的蛋白有许多种，CR就是其中的一种，主要在中枢神经和周围神经系统的某些神经元中表达。有学者发现CR对HD有标记[8-10]，但对CR标记新生儿HD研究较少。我们应用免疫组织化学染色方法，研究新生儿HD狭窄段肠壁神经组织中CR的表达，结果对照组全部为阳性，即正常肠壁黏膜下层和肌间层神经丛神经节细胞内呈棕黄色，而结肠黏膜细胞、肠壁肌细胞均无着色；实验组全部患儿呈阴性，显示没有神经节细胞的存在。本研究中CR免疫染色在对照组中，即非肠神经节病变中全部阳性，而CR在实验组新生儿HD患儿痉挛段表达全部缺失。在实验组中CR对新生儿HD患儿的检出率为100%，明显高于NSE%和S-100检出率(P<0.05)。

综上所述，通过CR免疫染色标记新生儿HD肠壁，对其诊断的敏感性大大提高，CR免疫染色可以作为新生儿HD诊断的一个辅助指标。

[参考文献]

[1] Glasiella，Gonzalez，Perez，et al.Neuroprotective action of Ginkgo biloba on the enteric nervous system of diabetic rats[J].World Journal of Gastroenterology，2011，2(7):898-905.

[2] 张哲，张鹏举.新生儿消化道穿孔36例临床分析[J].山东医药，2015，55(3)：82-83.

[3] 陈安，杜靖，杜立中.早期新生儿腹胀临床分析[J].中国当代儿科杂志，2013，15(12)：1074-1078.

[4] 杨利静，杨合英，贾佳，等.116例疑诊新生儿先天性巨结肠的诊治分析[J].临床小儿外科杂志，2015，14(4)：284-286.

[5] Montedonico S，Caceres P，Munoz N，et al.Canclini:creating Side-by-Side for more than 80 years[J].China Textile，2013，27(10):42-43.

[6] 侯金凤.钙视网膜蛋白诊断先天性巨结肠[J].中华小儿外科杂志，2014，35(7)：546-549.

[7] 朱伟雄，李雪清，严丽霞.神经标记物在先天性巨结肠中的表达[J].实用医学杂志，2014，30(13)：2136-2137.

[8] 朱进，安洪伟，赵涌，等.钙视网膜蛋白在先天性巨结肠病理诊断中的应用[J].第三军医大学学报，2012，34(19)：2005-2008.

[9] Holland SK，Ramalingam P，Podolsky RH，et al.Calretinin immunostaining as an adjunct in the diagnosis of Hirschsprung disease[J].Annals of Diagnostic Pathology，2011，15(5):323-328.

[10] 张艳，朱进，王士奇，等.钙视网膜蛋白在先天性无神经节细胞症中的表达特点及临床意义[J].重庆医学，2012，41(33)：3468-3470.